纤维素酶是一种复合酶系,它主要包含内切葡聚糖酶(CMC)、外切葡聚糖酶(CBH)、β-葡萄糖苷酶(BG)三种组分,在降解纤维素时三种组分起到协同作用。粗糙脉孢菌(V.crassa)作为一种真核模式生物,具有产纤维素酶的能力。本课题在前期研究中已经成功构建CBH过表达粗糙脉孢菌株60,本论文进一步考察过表达菌株对纤维素的降解能力,并对菌株所产的外切葡聚糖酶进行分离纯化及其酶学性质研究。本实验通过平板透明圈法和产酶曲线考察过表达菌株60产纤维素酶的能力,确定其在第7天时纤维素酶活力最高,过表达菌株60的菌丝生长量、降解羧甲基纤维素钠产生透明区域的能力都高于野生型菌株WT87-3。检测结果证明不仅转入过表达载体的外切葡聚糖酶活有较大提高,同时内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的活力也得到增强。进一步考察改变碳源、氮源、诱导物、金属离子对CBH过表达菌株60产纤维素酶的影响,结果表明,在5g麸皮基础培养基中加入1g秸秆、0.02g蛋白胨、0.025g纤维素和0.03g氯化钙时可使菌株60所产的外切葡聚糖酶活力从19.14U/mL提高到24.78 U/mL。为了验证菌株60对天然纤维素的降解能力,首先将纤维素原料麸皮进行酸处理,再采用固体发酵法进行酶解,结果表明其对纤维素的降解率达到30.2%,在降解过程中产外切葡聚糖酶达到26.4 U/mL,电镜照片显示菌株降解后麸皮原料中的纤维素结构从中间断裂、破碎。为了进一步分析外切葡聚糖酶的酶学性质,本实验利用镍柱亲和层析法对过表达菌株60所产的外切葡聚糖酶进行分离纯化,SDS-PAGE电泳确定该酶分子量为62KDa。外切葡聚糖酶学性质研究结果表明,该酶的最适作用温度为50℃,最适pH值为5,在4-6范围内酶活比较稳定;Na+、Mg2+、Ca2+、Mn2+对酶活力有促进作用,Pb2+和Li+具有很强的抑制作用;正庚烷和异丁醇使酶活力分别提高8.62%、4.61%;EDTA、Urea、DTT、H2O2抑制酶活力,其中EDTA抑制能力最强,酶活仅剩21.2%,表面活性剂Tween-20与Triton X-100能够促进酶活力,其中Tween-20促进能力最强,使酶活提高了 17.7%。在外切葡聚糖酶最适反应条件下,对其催化微晶纤维素的动力学参数进行测定,测得Km值结果为1.826 mg/mL,Vmax为2.39×10-3。