【摘 要】
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脯氨酰羟化酶2（Prolyl Hydroxylase,PHD2）是低氧诱导因子-1（HIF-1）稳定性和活性的关键调节因子,通过催化HIF-1α脯氨酸残基羟化,使其被泛素化进而被蛋白酶体降解。HIF-1α参与多种生理过程,其蛋白水平的上调促进血管的生成以及损伤组织的修复,因此,PHD2已成为肝组织损伤修复以及血管生成的重要靶点。由于现有的PHD2抑制剂具有一定的毒副作用,因此构建新型的安全有效的P
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脯氨酰羟化酶2（Prolyl Hydroxylase,PHD2）是低氧诱导因子-1（HIF-1）稳定性和活性的关键调节因子,通过催化HIF-1α脯氨酸残基羟化,使其被泛素化进而被蛋白酶体降解。HIF-1α参与多种生理过程,其蛋白水平的上调促进血管的生成以及损伤组织的修复,因此,PHD2已成为肝组织损伤修复以及血管生成的重要靶点。由于现有的PHD2抑制剂具有一定的毒副作用,因此构建新型的安全有效的PHD2抑制剂具有重要的意义。本实验室前期通过噬菌体抗体库筛选制备了在体内外均与PHD2特异性结合,同时还能够对其功能进行抑制的人源单链抗体（抗PHD2 sc Fv）,以抗PHD2 sc Fv基因为模板制备的抗PHD2胞内单链抗体,能够抑制PHD2脯氨酰羟化酶活性,并且具有促血管生成活性及对肝损伤的保护作用,但该抗体识别抗原的分子基础尚不清楚。抗原表位对抗原和抗体的相互识别至关重要,分析抗原与抗体的相互作用模式,首先需明确抗体识别的抗原表位。为了深入探究该抗PHD2单链抗体同抗原PHD2之间的相互作用的分子基础,本文通过表位预测软件,同源建模、分子对接计算机模拟结合突变验证实验,进行了抗PHD2单链抗体特异性识别的抗原表位分析。研究结果如下:1.利用SEPPA-3.0表位预测工具对重组人PHD2（rh PHD2）的表位进行预测,得到了25组可能参与构成rh PHD2表位的位点。依据SEPPA抗原表位预测结果,设计了1种rh PHD2截短突变和3种rh PHD2缺失突变。2.成功构建rhPHD2Δ130-209突变体的原核表达载体,可溶性表达和纯化重组人PHD2截短突变体rh PHD2Δ130-209蛋白,ELISA分析结果表明,rh PHD2Δ130-209与单链抗体具有良好的抗原结合活性,说明重组人PHD2蛋白的第130-209位氨基酸的缺失不影响抗原与单链抗体的结合,PHD2与抗PHD2单链抗体相互作用的表位集中在重组人PHD2的第1-129位氨基酸之间。3.成功构建PHD2缺失突变体,可溶性表达和纯化了3个PHD2缺失突变体rh PHD2Δ42-49、rh PHD2Δ54-58和rh PHD2Δ65-74,经过活性分析后发现65-74位氨基酸缺失的突变体丧失了与单链抗体结合的能力。这表明,重组人PHD2蛋白的65-74位残基是抗PHD2单链抗体识别PHD2的表位的关键组成部分。4.通过同源建模、分子对接计算机模拟抗PHD2单链抗体与PHD2的相互作用,结合重组人PHD2定点突变验证实验,发现重组人PHD2的第2位Gly,67位Gly,73位Glu突变都会降低与抗PHD2单链抗体结合活性,而且第67位Gly突变使其丧失与抗PHD2单链抗体的结合活性,因此第67位Gly不仅参与PHD2的表位形成,而且在重组人PHD2与抗PHD2单链抗体相互作用中担任着至关重要的作用。综上所述,本研究初步探究了抗PHD2单链抗体与PHD2的互作模式,为阐明抗PHD2单链抗体与PHD2相互作用的分子基础提供了实验依据,也为以PHD2为靶点的疾病治疗奠定了基础。
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