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实验背景及目的:急性ST段抬高型心肌梗死发生之后,溶栓或经皮冠状动脉介入等方法可以实现心肌血液再灌注,是减轻心肌梗死面积、减少减轻心室重构、改善患者预后的有效方法。然而,心肌再灌注常常引起缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,I/RI),可以进一步加重心肌的损伤,引起致命性心律失常,加重心力衰竭,带来更高的死亡率。I/RI的发生机制复杂,尚未被完全阐明。细胞自噬(autophagy)是指细胞在外界环境因素的影响下,对其内部受损的细胞器、错误折叠的蛋白质和侵入其内的病原体进行降解的生物学过程,是一种普遍存在的生理现象。研究报道,自噬参与心肌缺血/再灌注的病理过程,其过渡激活会引起心肌再灌注损伤。促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)在临床上是治疗贫血的常用药之一。Brines等利用EPO的空间三维结构重新合成促红细胞生成素衍生肽即螺旋B表面肽(helix B surface peptide,HBSP)。本课题组前期实验表明,HBSP能减轻由缺血/再灌注诱导的心肌细胞和内皮细胞损伤。然而,自噬是否参与HBSP对心肌缺血/再灌注损伤的保护尚不清楚。研究目的:1.观察心肌缺血/再灌注损伤是否能诱导自噬活动增强。2.观察HBSP是否能抑制心肌缺血/再灌注损伤诱导的自噬活动。3.探讨HBSP下调自噬减轻心肌缺血/再灌注损伤的机制。实验方法:1.用体重(20±2)g的健康雄性昆明小鼠,结扎前降支30min后恢复血流灌注,缺血25min后经腹腔注入生理盐水、HBSP及术前30min经腹腔注射Wortmannin,构建各组各组小鼠心肌/再灌注损伤模型。2.随机分成4组:假手术组(Sham)、缺血/再灌注组(I/R)、缺血/再灌注+HBSP组(I/R+HBSP)、缺血/再灌注+HBSP+Wortmannin组(I/R+HBSP+Wort)。3.使用Vevo770型小动物超声系统检测小鼠心功能。4.经伊文氏蓝/TTC染色后,检测各组小鼠心肌梗死面积。5.采用电镜观察各组小鼠自噬小体。6.采用Western blot检测各组小鼠心肌细胞相关蛋白表达及磷酸化水平。7.取2d内SD大鼠乳鼠,采取组织消化法,分离原代心肌细胞。随机分成4组,空白对照组(Control)、缺氧/复氧组(H/R)、缺氧/复氧+HBSP组(H/R+HBSP)、缺氧/复氧+HBSP+Wortmannin组(H/R+HBSP+Wort)。8.采用TUNEL检测各组原代心肌细胞凋亡情况。9.采用共聚焦显微镜检测各组原代心肌细胞LC3数量。10.采用Western blot检测各组原代心肌细胞相关蛋白表达及磷酸化水平。结果:1.小鼠心功能检测结果:与假手术组组对比,再灌注24h、7d,缺血/再灌注组左室射血分数、左室短轴缩短率显著下降。与缺血/再灌注组比较,再灌注24h、7d,缺血/再灌注+HBSP组左室射血分数、左室短轴缩短率显著增加。2.心肌梗死面积检测结果:再灌注24小时,与缺血/再灌注组比较,缺血/再灌注+HBSP组心肌梗死面积显著缩小。与缺血/再灌注+HBSP组比较,缺血/再灌注+HBSP+Wortmannin组明显增加。3.心肌细胞蛋白表达及磷酸化水平检测:与假手术组组对比,缺血/再灌注组LC3-II/LC3-I比值显著升高。与缺血/再灌注组比较,缺血/再灌注+HBSP组LC3-II/LC3-I比值显著下降。4.电镜观察结果:与假手术组组对比,缺血/再灌注组自噬小体明显增多。与缺血/再灌注组比较,缺血/再灌注+HBSP组自噬小体数量明显减少。5.细胞凋亡检测结果:与空白对照组对比,缺氧/复氧组细胞凋亡明显增多,与缺氧/复氧组比较,缺氧/复氧+HBSP组细胞凋亡明显减少。6.共聚焦显微镜检测结果:与空白对照组对比,缺氧/复氧组LC3荧光强度增强,与缺氧/复氧组比较,缺氧/复氧+HBSP组LC3数量明显减少。7.原代心肌细胞蛋白表达及磷酸化水平检测结果:与空白对照组对比,缺氧/复氧组Akt及mTOR的磷酸化水平升高,LC3-II/LC3-I比值升高,P62表达水平下降。与缺氧/复氧组比较,缺氧/复氧+HBSP组Akt磷酸化水平升高、mTOR的磷酸化水平升高LC3-II/LC3-I比值下降,P62表达升高。结论:促红细胞生成素衍生肽能显著抑制细胞自噬减轻小鼠心肌缺血/再灌注损伤,其保护效应可能与激活PI3K/Akt/mTOR转导通路相关。