论文部分内容阅读
根据世界卫生组织的《世界癌症报告》,肺癌约占癌症死亡总人数的20%。肺癌中80%为非小细胞肺癌,其中30%的原癌基因KRAS发生了突变。KRAS突变的非小细胞肺癌患者数量很多,但有效的临床治疗方法并不多,因此对KRAS突变的非小细胞肺癌的研究显得尤为重要。真核生物中抗增殖蛋白含有两个同源亚型抗增殖蛋白1(Prohibitin1,PHB1)和抗增殖蛋白2(Prohibitin2,PHB2)。近年来研究表明PHB2与肿瘤的发生和发展密切相关,所以PHB2在癌症治疗中的价值值得进一步深入研究。七鳃鳗是研究脊椎动物进化和适应性免疫的重要模式生物。与哺乳动物PHB2的广泛研究相反,七鳃鳗的PHB2的研究很少。本研究课题首先通过q PCR、Western blot和细胞免疫荧光三种方法探究PHBs在非小细胞肺癌NCI-H1650细胞、A549细胞、Calu-1细胞和NCI-H226细胞的表达情况,发现PHBs在肺腺癌NCI-H1650细胞,A549细胞和Calu-1细胞中高表达。在本课题组前期工作基础之上,将纯化的r Lm-PHB2(Recombinant lamprey PHB2 protein)蛋白与上述四种细胞共孵育,通过CCK法和流式细胞术分别检测细胞增殖和细胞周期,结果显示r Lm-PHB2将细胞阻滞在G2期抑制KRAS突变的A549细胞、Calu-1细胞和NCI-H226细胞增殖,其中对Calu-1抑制效果最为明显,且呈现浓度依赖性和时间依赖性。将构建的真核过表达载体p EGFP-N1-Lm-PHB2转染至四种细胞中检测Lm-PHB2对细胞增殖和细胞周期的影响,结果显示内源表达的Lm-PHB2将细胞阻滞在G2期抑制A549细胞和Calu-1细胞增殖。q PCR和Western blot检测发现Lm-PHB2不仅下调Calu-1细胞周期相关蛋白CDC25C、CCNB1、PLK1和Wee1的表达,还降低CCNB1和CDC25C的磷酸化水平,使Calu-1细胞阻滞在的G2/M期。随后划痕实验检测Lm-PHB2对细胞迁移的影响,发现Lm-PHB2可以抑制Calu-1细胞的迁移速率。Western blot检测迁移相关蛋白E-Cadherin和Vimentin蛋白的表达水平,发现Lm-PHB2可以抑制Calu-1细胞的上皮间充质转换,进而抑制其迁移。本研究发现Lm-PHB2不仅通过抑制周期相关蛋白的表达和磷酸化水平来抑制非小细胞肺癌A549细胞、Calu-1细胞的增殖活性,还可抑制Calu-1细胞的迁移速率。但作用的分子机制还有待进一步研究。本研究为非小细胞肺癌的早期诊断和靶向药物研发提供了线索。