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血吸虫病是由血吸虫感染引起的、危害严重的人畜共患寄生虫病,在78个热带和亚热带国家或地区流行。在我国流行的是日本血吸虫病,几十年来我国血吸虫病防控取得举世瞩目的成就,大多数地区人、畜血吸虫病的流行已呈现低流行性和低感染特点,传统的病原学诊断逐渐无法满足现场需求。本研究的目的是建立一种敏感性高、特异性强、便于判断的日本血吸虫病核酸诊断方法。在前期研究及生物信息学分析的基础上,本文选择G01、F11、E12、H12、G1/3、G7-1、G7-2和G7-3作为候选基因,分别设计引物并以日本血吸虫虫体基因组DNA、BALB/c小鼠基因组DNA和新西兰大白兔基因组DNA为模板进行基因扩增,挑选出能特异性从日本血吸虫虫体基因组DNA扩增,但不能从BALB/c小鼠和新西兰大白兔基因组DNA扩增出目的片段的基因。以G01作为诊断靶基因,三个不同感染剂量(10条、40条、100条)的小鼠各10只,在感染后42d提取血浆提核酸为模板,均可扩增得到G01片段。同时以弓形虫、大片形吸虫、前后盘吸虫、住肉孢子虫、旋毛虫、棘球绦虫的虫体基因组DNA为模板对G01进行扩增,均未扩增出目的片段,表明G01基因是一种有诊断潜力的靶基因。对引物、退火温度、模板量、血浆样本量进行优化,最终选取特征峰单一、对应Ct值较小的引物G01-4为检测引物;58℃为退火温度;4μL模板体积(核酸量约为8ng/μL);血浆样本量为200μL的反应体系和反应条件建立了Real-time PCR诊断方法,该方法的检测下限为0.01 fg。用该方法对感染10条、40条和100条日本血吸虫尾蚴42d的小鼠血浆样本进行检测,敏感性为99.3%(152/153)。检测77份未感染尾蚴的SPF级BALB/c小鼠血浆样本,均未检出阳性,其特异性为100%(77/77)。说明该方法具有较高的敏感性和特异性。应用建立的Real-time PCR诊断方法对感染10条和40条日本血吸虫尾蚴后不同时间的小鼠血浆样本进行监测。结果显示,感染10条尾蚴的小鼠在感染后7 d、10 d、14 d、18 d、21 d、28d、35 d、42 d后的阳性率分别为:40%(8/20)、60%(12/20)、30%(6/20)、40%(8/20)、20%(4/20)、60%(12/20)、60%(12/20)、95%(19/20)。感染40条尾蚴的小鼠在感染后10 d、14 d、18 d、21 d、28 d、35 d后的阳性率为:25%(2/8)、80%(4/5)、50%(4/8)、40%(2/5)、100%(8/8)、100%(5/5)。感染10条尾蚴的小鼠在感染后42 d的阳性率最高,为95%。感染40条尾蚴的小鼠在感染后28 d全部检出阳性。表明该方法的敏感性与感染度呈正相关。应用建立的Real-time PCR诊断方法对感染日本血吸虫的小鼠经吡喹酮治疗后的疗效考核进行研究。结果显示,感染10条和40条尾蚴的小鼠在给药治疗后6w时全部转为阴性,表明该方法具有疗效考核的潜力。本研究为日本血吸虫病防治提供了一种敏感、特异的诊断技术。