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第一部分、功能性纳米材料复合B-MBG支架对骨修复再生的作用研究目的:制备功能性纳米材料、复合B-MBG支架,探讨该复合材料在骨缺损修复再生过程中的作用及机制。材料和方法:制备金纳米笼（Au NC）,载入消退素D1（Rv D1）,外部包被RAW264.7细胞膜,即得到功能性纳米材料（M-Au NC）。透射电镜观察Au NC及M-Au NC的微形貌及结构,激光粒度仪测定粒径、电势,激光器及红外仪检测光热性能;紫外光谱仪检测吸收光谱,ELISA检测M-Au NC控释Rv D1效果,CCK8检测不同浓度Au NC的细胞毒性。流式检测创伤后机体局部炎性微环境变化。流式检测不同处理条件下巨噬细胞表面炎性因子受体的表达,Western blotting检测M-Au NC表面炎性因子受体的表达,ELISA、流式检测其体外吸附炎性因子能力及对中性粒细胞活性的影响。q PCR、Western blotting检测M-Au NC对巨噬细胞极化的影响及机制。将功能性纳米材料复合B-MBG支架植入小鼠股骨缺损处,24小时取部分标本,组织切片染色检测炎性细胞数目;术后第三天激光器照射术区,术后4天、4周取材,组织切片染色分别检测巨噬细胞极化、新骨形成。结果:透射电镜显示,Au NC成功被包被上巨噬细胞膜,厚度约为5μm;因细胞膜包被的影响,包膜后的Au NC粒径稍有增加、电势稍有降低,但是包膜后的升温曲线未发生改变且具有可重复性,二者在780-800nm处可见明显吸收峰,且808nm激光照射后,功能性纳米材料内载有的Rv D1能够成功被释放;CCK8结果显示,≤50μg/ml的Au NC无细胞毒性。流式结果表明,创伤后局部炎性因子TNF-α、IL-6急剧增加,24小时达峰值,2天及4天较24小时有所减少,但仍保持高水平;中性粒细胞创伤后迅速增加,24小时达峰值,2天时较24小时有所减少,4天时基本同6小时;单核细胞于创伤后6小时开始逐渐增加,24小时达峰值,之后急剧下降,4天时极少;巨噬细胞从创伤后12小时开始逐渐增加,24小时达峰值,2天及4天虽然稍有减少,但仍保持较高水平。流式及Western blotting检测结果显示,LPS刺激后巨噬细胞表面炎性因子受体CD120a及CD126表达增加,功能性纳米材料表面的炎性因子受体的表达基本同巨噬细胞本身;ELISA结果表明,功能性纳米材料体外能够吸附炎性因子TNF-α、IL-6,且进一步流式结果显示其能够抑制腹腔中性粒细胞的活性。q PCR结果显示,功能性纳米材料经近红外激光照射后,体外能促进M2型巨噬细胞基因的表达而抑制M1型基因的表达,q PCR结果显示,体外10-9M Rv D1即可明显抑制巨噬细胞M1向极化相关基因的表达,且与PI3K-AKT以及ERK信号通路的激活相关。体内组织染色显示,功能性纳米材料复合B-MBG支架植入小鼠股骨缺损处后,24小时时明显抑制CD11b阳性的炎性细胞数目;术后第三天激光照射后,第4天ARG1阳性的巨噬细胞明显增加;术后4周标本H＆E、Masson及I型胶原免疫组化染色显示,功能性纳米材料组有更多的新生骨,另外,与不含纳米材料组比,不含Rv D1的纳米材料也具有一定的促进新骨形成的能力。结论:功能性纳米材料通过表面的炎性因子受体吸附环境中的炎性因子,而抑制炎性细胞活性,通过释放Rv D1激活PI3K-AKT及ERK信号通路而促进巨噬细胞M2向极化,促进组织修复,复合B-MBG支架后,增强体内骨修复再生效果。第二部分、组蛋白甲基化酶Setd7在B-MBG支架促进成骨中的作用研究目的:探讨B-MBG支架体内促进骨缺损修复效果及Setd7在其中的作用。材料和方法:建立大鼠OVX模型及股骨缺损模型,并植入MBG支架、B-MBG支架,通过体内组织染色,分析MBG支架及B-MBG支架材料促进股骨缺损修复的效果差异。利用RNA-seq分析体内组织的成骨基因表达,并检测体内骨组织标本中甲基化酶及非甲基化酶的表达差异。免疫荧光共定位确认目的蛋白的细胞定位。MBG及B-MBG支架浸提液培养人骨髓间充质干细胞human BMSCs,进行CCK-8、Realtime-PCR、ALP染色及茜素红染色选择最适的浸提液浓度,用于后续实验。KEGG分析B-MBG支架材料促进成骨的相关通路变化,体外用MBG及B-MBG支架浸提液分别刺激human BMSCs,检测相关通路蛋白的变化。利用sh RNA技术干扰human BMSCs中的目的基因,检测细胞成骨能力变化。结果:组织学染色显示,与MBG支架相比,B-MBG支架能促进OVX大鼠股骨缺损的修复再生。RNA-seq分析表明,B-MBG组成骨基因表达明显高于MBG组,且甲基化酶及非甲基化酶的表达上调,以Setd7最为明显。体内组织切片免疫组化学染色显示,B-MBG组中Setd7及H3K4me3表达明显高于MBG组,且免疫荧光染色发现,二者均能与Runx2阳性细胞共定位于核内。KEGG分析发现,B-MBG支架促进成骨与Wnt/β-catenin信号通路激活相关,体外用浸提液刺激human BMSCs,确认Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的变化。干扰Setd7基因后,human BMSCs的成骨能力减弱,且不能因B-MBG浸提液的加入而改善。结论:含硼多孔生物活性玻璃B-MBG通过释放硼,激活Wnt/β-catenin信号通路而促进组蛋白甲基化酶Setd7的表达,从而促进h BMSCs成骨向分化及体内骨缺损修复再生。