慢性阻塞性肺病（Chronic obstructive pulmonary disease,COPD）是一种持续性的气流受限,并伴随着由于有毒颗粒或气体引起的气道与肺中慢性炎症的疾病。COPD现成为全球死亡率和发病率的一个重要原因,预计到2020年,COPD将在中国疾病负担中排名第一。COPD患者的呼吸道及肺部炎症是呼吸道对刺激物的炎症反应,具体机制尚不明确。目前研究表明,COPD重要的致病机制之一是氧化应激,而且氧化应激会进一步恶化COPD。香烟烟雾等氧化剂进入体内会导致巨噬细胞和中性粒细胞等激活促进炎症细胞释放炎症因子,同时内源性抗氧化剂减少进一步导致氧化还原失衡,最终导致病情恶化。现有用于COPD的药物主要有三类:支气管扩张剂、糖皮质激素和选择性磷酸二酯酶抑制剂。这些药物虽然可以通过松弛平滑肌或减少炎症分泌来缓解呼吸困难等症状,却没有一个药物能够改变患者肺功能的长期下降。因此,研发不仅解决COPD患者表面症状的新药仍然迫在眉睫。针对氧化应激的抗氧化剂新药研究是目前抗COPD药物开发的一个新方向。近期上市的吸入用N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC）,药品名Mucomist? Respirator Solution)就是一个典型的抗氧化药物。诸多临床实验表明,NAC能够缓解COPD的恶化,改善肺功能。NAC抗COPD的作用机制有以下三种:①其中的-SH可与过氧化物H2O2发生作用,起到调节氧化应激的作用;②可以间接提高体内GSH水平发挥抗氧化作用;③通过还原痰蛋白中的二硫键降低其粘度,增加痰排放。包括本课题组在内的诸多研究结果表明老蒜提取物（aged garlic extract,AGE）中主要的活性成分之一 S-烯丙基巯基半胱氨酸（S-allylmercaptocysteine,SAMC）在抗 COPD 的机制与 NAC 类似,而且 SAMC和NAC衍生物S-烯丙基巯基-N-乙酰半胱氨酸（S-allylmercapto-N-acetylcysteine,ASSNAC）体内外抗氧化活性均优于NAC。因此推测SAMC衍生物可能在治疗COPD方向是具有前景的化合物。本文将SAMC作为抗COPD先导化合物,通过衍生化设计合成得到抗氧化抗炎双重活性更高的候选化合物。本论文是以SAMC为先导化合物设计合成了 28个衍生物,并通过测定其体外抗炎和抗氧化的活性探索出该类化合物的构效关系。然后从中挑选出4个活性较好并具有结构代表性的化合物进行理化性质测定,评价其成药性。另外,本课题通过对测定了 SAMC主要活性代谢产物甲基烯丙基砜（methylallyl sulfone,AMS02）体内外抗COPD的活性评价,进一步阐明了该类化合物经代谢后的体内作用功效和机制。本论文研究分为以下四个部分:（1）SAMC衍生物的合成;（2）SAMC衍生物体外抗COPD初步活性评价;（3）4个典型衍生物物理化学性质的研究;（4）SAMC主要代谢产物AMS02预防COPD的体内外活性及机制研究。1.SAMC衍生物的合成:本章以SAMC为先导化合物,保持二硫键不变,主要针对烯丙基基团做了修饰。我们设计合成了四类SAMC衍生物（共28个SAMC衍生物）:杂环类（1个,其中3个为课题组前期已完成）、苄基类（16个,其中2个为课题组前期已完成）、非苄基类（4个）以及脂肪类（4个）。根据实验室前期研究成果与查阅相关文献后,最终确定合成路线是将L-无水半胱氨酸与甲氧羰基磺酰氯在甲醇溶液反应得到中间体3-甲氧羰基二硫-L-丙氨酸盐酸盐,之后中间体与带有不同取代基的硫醇反应生成最终产物。第一步中间体合成的产率可以达到68%,但终产物合成的产率差距较大,从30.2%到82.2%不等。第二步产率差距如此之大的原因主要是不同硫醇在甲醇或乙醇中溶解度差距大引起的。所有衍生物的化学结构经过1HNMR和高分辨质谱确认。2.SAMC衍生物体外抗COPD初步活性评价:众多文献验证了烟雾不仅通过对免疫系统的影响造成肺组织的破坏,而且其中的高浓度活性氧也可以引起细胞氧化损伤,最终导致炎症细胞在支气管和肺部聚集,最终导致COPD。因此,本课题通过香烟烟雾提取物（Cigarette smoke extract,CSE）与RAW264.7细胞共培养建立了体外细胞模型。通过测定上清中NO含量变化可以快速筛选出28个SAMC衍生物抗炎活性,结合体外清除1,1-二苯基-2-三硝基苯腈（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH）自由基的能力得到该类衍生物的构效关系。所合成的SAMC衍生物初步抗炎活性构效关系总结如下:①杂环衍生物抗炎活性明显提高;②苯环类衍生物中,邻对位取代活性明显高于间位和未取代;③邻对位为供电子基团时活性更好;④非氨基酸端二硫键的硫需连接一个具有sp2或sp3杂化的碳原子抗炎活性更好。对于SAMC衍生物初步抗氧化活性构效关系总结如下:①非氨基酸端二硫键的硫需连接一个具有sp2或sp3杂化的碳原子抗氧化活性更好;②引入苯环后抗氧化活性增加;③苯环上间位和对位引入强吸电子基（-CF3和-F）抗氧化活性提高5-50倍;④当邻位引入取代基时活性增加,引入供电子基团活性好于吸电子基团。本章结果显示筛选出的杂环衍生物（CPD-a1-a4）具有较强的抗炎抗氧化活性,抗炎活性比已上市的药物N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）至少高4倍,抗氧化活性比SAMC高15-70倍,值得进一步研究。3.4个典型SAMC衍生物理化性质的研究:本章利用新建立的定量分析方法对4个具有较高成药性的SAMC衍生物CPD-a1、CPD-b13、CPD-b16和CPD-d1进行了以下理化性能评价:不同pH值的溶解度、脂水分配系数、强酸强碱高温高湿条件下的稳定性。LogP结果显示杂环与苯环（CPD-a1和CPD-b13）的引入确实提高了该类化合物的脂溶性。4个衍生物在不同pH值中的溶解性与SAMC类似,酸性条件下溶解性明显好于碱性;而且72 h酸碱稳定性测试结果说明,SAMC类衍生物在酸性条件下比碱性条件下更稳定,提示该类化合物在胃中吸收可能比在肠中好。在高温（60±5℃,10 d）和高湿（25℃,90%±5%,10 d）条件下,CPD-a1与CPD-b13外观与性状均未发生变化,经HPLC也未检测出新杂质;虽然CPD-d1在高温条件下,外观颜色变为微黄,但未检测出新杂质,且高湿条件下性状未发生变化亦未检测出新杂质。值得说明的是,CPD-b16表现出极不稳定的化学性质,pH>10碱性条件、超过24 h的酸性条件、高温与高湿条件下均变质,甚至是在饱和水的正辛醇和饱和正辛醇的水溶液中,均无法检测到原型药物,由此可以看出,CPD-b16不具备成药性。结合第三章实验结果,CPD-a1相比与SAMC具有更高的脂溶性,稳定性相似,且抗炎抗氧化活性更好,可见该类化合物具有最高成药性。4.SAMC主要代谢产物AMS02预防COPD的体内外活性研究:本章采用连续三周每周给老鼠注射CSE方式建立体内COPD模型,AMS02给药方式为腹腔注射给药。处死老鼠后,收集老鼠肺灌洗液、血清及肺组织,记录肺灌洗液中炎症细胞的分类及数量,评价血清及肺组织中炎症因子和氧化应激标志物的表达以及评估了肺组织的形态学变化。实验结果表明,AMS02可以降低肺灌洗液中炎症细胞的数量;在低剂量预防组中,血清和肺组织中炎症细胞因子及氧化应激的水平均下降,同时肺组织形态学变化明显。CSE诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7和人肺纤维细胞HFL-1的方式建立了COPD体外细胞模型,考察了 AMS02的抗炎抗凋亡功效及作用机制。使用DAPI染色及流式细胞仪测定了 AMS02对细胞凋亡的影响,而AMS02对CSE诱导的细胞蛋白表达的影响则采用Western blot技术来检测。实验数据表明AMS02在体外逆转了 CSE对细胞的损伤,其保护作用可能是通过调节MAPK及NF-kB信号通路来实现抗炎,而通过调节MAPK、Nrf-2及Bcl-2来实现抗凋亡。综上所述,本课题首先以具有较好抗氧化和抗炎的活性SAMC为抗COPD的先导化合物,合成了 28个衍生物,通过测定这些衍生物的抗炎和抗氧化活性,初步探索了其构效关系,活性检测结果表明部分衍生物的抗COPD的活性明显高于SAMC;然后,对其中4个具有结构代表性且活性较好的衍生物开展了理化性能评价,结果显示衍生物CPD-a1具有较高的成药性;最后,鉴于该类有机硫化物在体内快速降解为多个活性代谢产物,本课题以SAMC为药物范例研究了其体内主要活性代谢产物AMS02的抗炎和抗氧化功效和作用机制。与现有抗COPD抗氧化剂NAC相比,本课题所合成的、具有较高成药性的部分SAMC衍生物通过进一步深入研究有望开发成为具有抗氧化和抗炎双重功效的新型抗COPD原创药物。