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牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)是公认的牙周炎的主要致病菌之一,其产生的内毒素(lipopolysaccharide,LPS)对牙周组织具有很高的毒性和抗原性,可导致牙周附着的丧失和牙槽骨的吸收。牙周韧带细胞(Periodontal Ligament Cells,PDLCs)作为牙周韧带内主要的功能细胞,在牙周的愈合和再生中发挥着重要的作用。大量的研究表明,牙龈卟啉单胞菌内毒素(Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide,Pg-LPS)能通过诱导炎症反应直接或间接地毒害PDLCs,且牙周病病变的发展与LPS的含量密切相关。血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)作为PDLCs潜在的促有丝分裂因子,在牙周组织的损伤愈合中发挥着重要的作用。目的研究不同浓度Pg-LPS单独或联合PDGF-BB共同作用于PDLCs后对其损伤模型愈合的影响,以及通过研究Pg-LPS对PDLCs在牙骨质片上附着和增殖的影响,探讨Pg-LPS在牙周组织修复再生中的作用。方法1.采用组织块培养法体外培养人PDLCs,免疫细胞化学检测波形丝蛋白以确定其组织学来源。取生长良好的第4代PDLCs接种于12孔板,待细胞融合后制备成约8mm的圆形损伤模型,加入0、0.001、0.01、0.1、1和10μg/ml的Pg-LPS培养液培养,3d后换成不含LPS的培养液继续培养,损伤后的第1、3、6、9、12d结晶紫染色观察损伤区细胞愈合情况。乙酸溶解提取后,检测损伤后各组细胞的数量变化;同时,ELISA法检测1d、3d、6d损伤愈合时PDLCs分泌IL-1β、IL-6、TNF-α水平的变化。2.采用10ng/ml的PDGF-BB和Pg-LPS(0、1、10μg/ml)共同作用于PDLCs损伤模型,于损伤的第3d时,换成不含LPS而只含有PDGF-BB的培养液继续培养,检测损伤后的第1、3、6、9d各组细胞的数量及细胞覆盖损伤区域的情况。3.用含不同浓度(0、1、10μg/ml)Pg-LPS培养液培养PDLCs于牙骨质片,24h、72h后用MTT法检测PDLCs在牙骨质片上的附着、增殖的细胞数量,扫描电镜观察其在牙骨质片上附着、增殖的形态。AO/EB染色观察不同浓度Pg-LPS对PDLCs凋亡的影响。结果1.通过组织块法分离培养的PDLCs表达波形丝蛋白,属于中胚层来源的细胞,具有良好的增殖能力。低浓度Pg-LPS(0.001-1μg/ml)对PDLCs损伤愈合时细胞数量的增殖影响不明显(P＞0.05);而高浓度10μg/ml Pg-LPS对PDLCs的增殖有明显的抑制作用(P＜0.05),延缓了PDLCs的损伤愈合。此外,10μg/mlPg-LPS组刺激PDLCs后,分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α水平也明显高于其余各组(P＜0.05),而低浓度Pg-LPS(0.001-1μg/ml)组与对照组相比则无明显差异(P＞0.05)。2.低浓度Pg-LPS(0.001-1μg/ml)对PDGF-BB促PDLCs损伤愈合无影响(P＞0.05);高浓度10μg/ml Pg-LPS抑制了PDGF-BB促PDLCs损伤愈合(P＜0.05)。3.在附着实验和增殖实验中,高浓度10μg/ml Pg-LPS组PDLCs细胞数量明显低于对照组(P＜0.05),而1μg/mlPg-LPS组PDLCs细胞数量与对照组差异无统计学意义(P＞0.05)。同样,10μg/ml Pg-LPS能诱导PDLCs的凋亡。结论1.Pg-LPS对PDLCs的增殖抑制作用与其浓度有密切关系。2.Pg-LPS在一定的低浓度范围内(0.001-1μg/ml),不会影响PDLCs在牙骨质片上的附着、增殖,提示在牙周炎治疗进行根面平整时,通过大量的刮除牙骨质来彻底地去除LPS可能是没有必要的。