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第一部分纤维环YAP蛋白区域性表达与胶原纤维直径和弹性模量的关系[摘要]目的:探讨纤维环沿径向不同区域的YAP蛋白表达及其与胶原纤维拓扑结构以及弹性模量的关系。方法:获取新西兰白兔的纤维环组织,原子力显微镜观察纤维环内、中、外三区胶原纤维直径大小,纳米压痕测试检测各区纤维环微观力学特性,免疫组化、免疫荧光以及Western Blot法检测各区细胞YAP和磷酸化YAP的表达情况。RT-qPCR检测纤维环各区细胞表型标志基因表达情况。结果:原子力显微镜扫描显示,纤维环胶原纤维呈定向排列,且内区胶原纤维直径较小,外区直径较大,中区的直径则介于内外区之间;纳米压痕测试显示由内、中到外区纤维环组织弹性模量呈递增趋势。免疫组化、免疫荧光以及Western Blot结果表明由内、中到外区YAP核转录水平逐渐增高,而磷酸化水平逐渐降低。PCR结果示Col-Ⅰ,Col5a1,Adamts17,Sfrp2,Col12a1在纤维环外区细胞中表达较高,而Col-Ⅱ和Aggrecan在纤维环内区细胞中表达较高。结论:椎间盘纤维环YAP的表达、细胞表型标志基因的表达、胶原纤维的直径及弹性模量在沿径向内、中、外区域呈现明显的差异性,随着胶原纤维直径以及弹性模量的增高,YAP的核转录水平增高,磷酸化水平降低,YAP的激活水平与胶原纤维的直径以及弹性模量大小存在明显的依赖关系。第二部分YAP在不同直径的纺丝支架诱导纤维环源干细胞分化中的作用[摘要]目的:考察转录效应因子YAP在不同直径的静电纺丝支架诱导纤维环源干细胞分化中的作用。方法:将兔纤维环源干细胞种植在三种不同直径的静电纺丝支架上,培养7天后,细胞骨架染色及扫描电镜观察细胞形态特征,PCR检测各组细胞纤维环细胞标志基因的表达;免疫荧光及Western Blot检测YAP核转录及黏着斑蛋白Vinculin的表达情况;PCR检测肌腱/韧带相关基因Bgn,Mkx以及Dcn的表达。结果:细胞骨架染色和扫描电镜分析结果显示,静电纺丝支架的纤维直径对细胞形态影响明显。在小直径的支架上,细胞皱缩呈圆形,而在大直径的支架上,细胞铺展较好,呈梭形;结果显示随着纤维直径的增加,纤维环外区标志基因(Col-Ⅰ,Co15a1,Adamts17,Sfrp2,Col12a1)表达升高,内区标志基因(Col-Ⅱ和Aggrecan)表达降低。免疫荧光结果显示,随着纤维直径的增加,Vinculin大量成熟表达,YAP的入核增多,激活Bgn,Mkx以及Dcn等韧带相关基因的表达。结论:不同直径的静电纺丝支架可以诱导纤维环源干细胞分泌与天然纤维环组织拓扑结构区域相一致的细胞外基质的分泌,其作用机制可能与YAP的激活相关联。第三部分YAP在支架的拓扑结构和弹性模量双重调控纤维环源干细胞分化中的作用[摘要]目的:探究纺丝支架的拓扑结构和力学特性对纤维环源干细胞分化的双重影响,并进一步探究其作用机制是否与YAP相关。方法:分别构建了四种聚氨酯纺丝支架(低弹性,小直径;高弹性,小直径;低弹性,大直径;以及高弹性,大直径)来诱导纤维环源干细胞的黏附及分化。扫描电镜观察细胞的形态特征,RT-PCR检测纤维环细胞标志基因的表达情况;免疫荧光检测黏着斑蛋白Vinculin的表达以及YAP的核转录情况。RT-PCR检测韧带相关基因Col14a1,Msx2和Scx的表达。结果:扫描电镜结果显示,相对于支架的弹性模量,纤维直径对细胞形态的影响较大,在大直径的纺丝支架上,细胞Vinculin表达较成熟,细胞铺展较好。支架的拓扑结构对纤维环源干细胞的分化有显著影响,在弹性模量不变的情况下,随着支架直径的增加,纤维环外区标志基因(Col-Ⅰ,Col5a1,Adamts17,Sfrp2,Col12a1)表达升高,内区标志基因(Col-Ⅱ和Aggrecan)表达降低。此外,支架的弹性模量对纤维环源干细胞的分化同样具有重要的影响,在纤维直径不变的情况下,随着支架弹性模量的增加,纤维环外区标志基因表达升高,内区标志基因表达降低。免疫荧光以及Western Blot显示,支架的拓扑结构和弹性模量都可以通过影响YAP的激活来影响韧带相关基因的表达,进一步影响细胞外基质的表达。结论:静电纺丝支架的弹性模量及拓扑结构均可调控纤维环源干细胞的分化,两者具有一定的协同作用,其作用机制可能与YAP激活相关。第四部分拓扑结构和力学特性仿生的组织工程椎间盘用于大鼠尾椎间盘再生[摘要]目的:考察拓扑结构和力学特性仿生的组织工程椎间盘对大鼠尾椎间盘再生修复情况。方法:通过调整聚氨酯材料的弹性模量以及纺丝液的浓度分别制备出高弹性、大直径的纺丝纤维膜用来模拟纤维环的外区,用低弹性、小直径的纺丝纤维膜用来模拟纤维环的内区,将纤维膜按照天然纤维环内、外两区的特点进行斜交叠卷曲形成仿生纤维环组织,将其植入到大鼠尾椎间盘切除部位,用均一单相支架组和椎间盘切除组作为对照,力学测试检测二相支架、单相支架以及天然椎间盘组织的抗压能力,MRI以及组织切片染色考察二相仿生椎间盘的再生修复情况。结果:压缩测试结果显示,较单相支架组,二相支架组仿生椎间盘可承受较大压缩力,较天然椎间盘无显著差异。MRI显示在术后1月时仿生椎间盘在位,二相支架组髓核含水量较天然椎间盘组无显著差异,椎间隙较天然椎间盘组无显著差异,单相支架组髓核含水量较天然椎间盘组降低,且椎间隙较天然椎间盘组显著降低,椎间盘切除组在1月后椎间隙融合消失。H&E染色示二相组仿生椎间盘与上下软骨终板融合,支架内部有基质蛋白沉积以及新生组织长入。结论:通过模拟纤维环的拓扑结构和力学特征构建出的二相仿生椎间盘可以很好模拟天然纤维环的结构和功能,该二相仿生椎间盘可以承受与天然椎间盘相似的压缩力,且与上下终板紧密结合并维持组织工程髓核的含水量,利于新生细胞的长入,为精确构建具有功能性的组织工程椎间盘提供了新的思路。