肉桂叶非挥发性活性物质提取及其生物活性研究

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肉桂(Cinnamomum cassia)是樟科樟属的热带、亚热带常绿乔木,在广东、广西等地有大面积栽培。肉桂树皮的开发利用程度高,被用作药材或香料,而肉桂叶的用途较为单一,通常用于生产肉桂精油。然而,肉桂精油的提取率仅为0.8%-1.2%,提取挥发油后剩余大量的肉桂叶残渣,这些残渣常被用作燃料或直接废弃,造成自然资源的浪费和环境污染。肉桂叶残渣,即肉桂叶的非挥发部分,可能存在大量的活性物质,具有潜在的应用价值,但其相关研究较少。因此,研究肉桂叶非挥发部分的生物活性、为其综合利用和深度开发提供依据十分必要。有鉴于此,本课题首先初步探索肉桂叶非挥发成分的生物活性,研究提取条件对提取物抗氧化活性的影响规律,并对提取物的活性成分进行分析,在此基础上,进一步利用细胞实验研究其抗炎活性,并通过动物实验研究其抗衰老活性及对肠道微环境的影响。本论文的主要研究内容及结果如下:(1)肉桂叶非挥发成分的提取及活性评价首先,研究肉桂叶非挥发成分的乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和水提取物的生物活性,结果表明其抗氧化活性较强,而抑菌活性和降血糖活性较弱,且乙醇提取物在三种提取物中抗氧化活性最强,而发挥抗氧化作用的物质可能是多酚类化合物。其次,研究提取条件对乙醇提取物抗氧化活性的影响,结果表明最适提取条件为:乙醇体积分数80%、提取温度60℃、液料比16:1 mL/g,在此条件下提取物的得率为11.60%,总酚得率为2.71%,总黄酮得率为6.15%,且提取物浓度为120μg/mL时DPPH自由基清除率达到80.65%。再者,利用超高效液相色谱电喷雾静电场轨道阱质谱技术(UHPLC-ESI-Orbitrap-MS)指认出乙醇提取物中的14种化学成分,其中多酚类成分有槲皮甙、鼠尾草酚、鸢尾甲黄素B、异泽兰黄素等。最后,利用脂多糖诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7产生促炎因子NO模型证明乙醇提取物具有较强的抗炎活性,其浓度为200 μg/mL时NO抑制率为76.67%。(2)肉桂叶非挥发成分的抗衰老活性研究采用D-半乳糖诱导小鼠衰老模型研究乙醇提取物(以下简称提取物)的抗衰老活性,结果表明其较强的抗衰老活性主要表现在四个方面:第一,高剂量提取物可使衰老模型小鼠的脑指数、肝脏指数和肺指数恢复到正常水平;第二,在血清指标方面,提取物可提高衰老模型小鼠血清中总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活力、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活力和总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)以及降低血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量来增强小鼠抗氧化防御能力,可提高血清白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)水平、降低肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素 1β(interleukin-1β,IL-1β)水平来缓解体内炎症反应;第三,在脑组织方面,提取物可提高衰老模型小鼠脑中乙酰胆碱转移酶(acetylcholine transferase,ChAT)活性、降低乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AchE)活性,使乙酰胆碱含量恢复正常水平来保护胆碱能系统、延缓脑衰老,可提高脑中T-SOD活力、GSH-Px活力和T-AOC,上调脑中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)蛋白表达水平,降低脑中MDA含量来增强小鼠脑组织抗氧化防御能力,可降低脑中诱导型一氧化氮合酶(induced nitrogen monoxide synthase,iNOS)活力和 NO 含量,下调脑 iNOS、TNF-α蛋白表达水平来抑制脑内炎症反应;第四,在肝脏组织方面,肝脏病理学切片证明提取物可减轻衰老模型小鼠的肝脏损伤、保护和修复肝脏组织,且提取物可提高小鼠肝脏T-SOD活力、GSH-Px活力和T-AOC,上调肝脏SOD、GSH蛋白表达水平,降低肝脏MDA含量来增强小鼠肝脏抗氧化防御能力,可降低肝脏iNOS活力和NO含量,下调肝脏iNOS、TNF-α蛋白表达水平来抑制肝脏炎症反应。(3)肉桂叶非挥发成分对衰老模型小鼠肠道菌群的影响对小鼠肠道菌群进行高通量测序,并进行Alpha多样性分析、Beta多样性分析、偏最小二乘法判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)、菌群组成分析、线性判别分析(linear discriminant analysis effect size,LEfSe),结果表明提取物可增加衰老模型小鼠肠道菌群的群落多样性、减少衰老模型小鼠与正常小鼠的肠道菌群组成的差异,可升高衰老模型小鼠肠道厚壁菌门/拟杆菌门的比值,增加肠道有益菌的丰度。此外,采用苏木精-伊红染色观察小鼠结肠组织形态,结果显示提取物可减轻衰老模型小鼠结肠组织的受损程度,其机理可能为提取物对肠道菌群的调节作用。本课题的研究为肉桂叶非挥发性活性物质在功能性食品领域的应用提供了理论依据,并将推动肉桂叶残渣的深度开发和综合利用。
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