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研究背景:结核病（TB）是由结核分枝杆菌（MTB）感染引起的慢性传染性疾病。近年,多重耐药结核分枝杆菌的出现给结核病的防控带了巨大挑战。巨噬细胞是机体抵御结核分枝杆菌入侵的第一道防线。已有的研究表明,巨噬细胞M1/M2极化与结核分枝杆菌感染进程及结核发病密切相关,但相关机制尚未完全阐明。N~6-甲基腺嘌呤（m~6A）修饰是真核生物mRNA最重要的甲基化修饰形式之一,是一种动态可逆的表观遗传修饰,由甲基转移酶催化形成,并可在去甲基酶的作用下去除。m~6A形成后可以被m6A阅读蛋白或结合蛋白识别,进而调控mRNA的稳定性、翻译、出核等过程,从而实现对基因表达的转录后调控。甲基转移酶样蛋白3（METTL3）是甲基转移酶复合物中主要的催化亚基,参与mRNA翻译和出核过程的调控。近年研究显示,METTL3介导的m~6A修饰在机体免疫应答过程中发挥了重要调控作用。然而,METTL3在结核病中的作用及机制尚不清楚。研究目的:探讨m~6A甲基转移酶METTL3在MTB感染巨噬细胞过程中的表达变化,以及其在巨噬细胞极化中的作用及相关机制。研究方法:1、采用实时定量荧光PCR（RT-qPCR）分别检测肺结核患者和健康对照外周血单个核细胞（PBMC）中m~6A修饰酶相关基因表达水平。采用结核分枝杆菌H37Ra以MOI=10感染THP-1来源巨噬细胞,在感染后不同时间点（0h、4h、6h、12h、24h、48h）,采用RT-qPCR和Western blot比较METTL3的表达情况。2、以THP-1巨噬细胞为研究对象,采用LPS和IFN-γ诱导巨噬细胞M1极化,IL-4诱导巨噬细胞M2极化。采用RT-qPCR和Western blot检测不同极化状态下的巨噬细胞中METTL3表达差异。3、构建过表达和沉默METTL3的慢病毒载体,包装慢病毒,转染THP-1巨噬细胞构建稳转细胞株,鉴定稳转细胞株METTL3的表达改变和m~6A水平变化后,采用MTB对稳转细胞株进行感染,在此基础上采用RT-qPCR检测感染后不同时间点巨噬细胞极化表面标志物表达情况,采用比色法检测精氨酸酶活性以及亚硝酸盐含量,采用ELISA检测细胞培养上清中IL-10、IL-12p40、TNF-α和CCL17含量,采用固体培养法检测巨噬细胞内荷菌量的改变。4、采用RT-qPCR检测沉默METTL3后其下游靶基因SOCS2的表达变化。采用Me RIP-qPCR检测METTL3对SOCS2 mRNA的m~6A修饰作用。RNA稳定性实验检测沉默METTL3对SOCS2 mRNA稳定性的影响。在沉默METTL3的巨噬细胞中转染SOCS2小干扰RNA（si-SOCS2）,检测巨噬细胞极化表型、细胞因子分泌水平以及荷菌量变化。5、构建沉默m~6A结合蛋白YTHDF2的慢病毒载体,包装慢病毒,转染THP-1巨噬细胞,构建结核分枝杆菌感染模型,采用RT-qPCR检测SOCS2 mRNA的水平变化。RNA稳定性实验检测沉默YTHDF2对SOCS2 mRNA稳定性的影响。研究结果:1、与健康对照相比,肺结核患者PBMCs中METTL3 mRNA及蛋白表达均显著下调。结核分枝杆菌感染后巨噬细胞METTL3表达下调。2、RT-qPCR和Western Blot结果显示METTL3在M1型巨噬细胞中表达下调,在M2型巨噬细胞中表达上调。3、过表达METTL3可上调巨噬细胞m~6A水平,沉默METTL3则下调巨噬细胞m~6A水平。过表达METTL3的巨噬细胞在感染结核分枝杆菌后胞内精氨酸酶活性显著上调,亚硝酸盐含量减低,同时M2标志物Arg1、CCL17、CCL18、CD163和IL-10的表达显著上调,M1标志物HLA-DR、IL-1B、TNF-α、i NOS和IL-12p40的表达显著下调。沉默METTL3的巨噬细胞在感染结核分枝杆菌后其精氨酸酶活性及亚硝酸盐含量的变化则相反,同时M1标志物TNF-α和IL-12p40的表达显著上调,M2标志物IL-10和CCL17的表达则显著下调。4、菌落计数结果显示,过表达METTL3可显著促进巨噬细胞内结核分枝杆菌的存活,沉默METTL3则显著增强巨噬细胞杀伤结核分枝杆菌的能力。5、沉默METTL3后巨噬细胞中SOCS2的表达显著上调。Me RIP-qPCR检测发现m~6A抗体可以富集到发生m~6A修饰的SOCS2。沉默METTL3可下调SOCS2 mRNA的m~6A水平,同时显著增强SOCS2 mRNA的稳定性。6、在稳定低表达METTL3的巨噬细胞中下调SOCS2的表达诱导巨噬细胞向M2方向极化,同时降低巨噬细胞杀伤结核分枝杆菌的能力。7、在巨噬细胞中沉默YTHDF2可增加SOCS2 mRNA的稳定性,上调SOCS2的水平。研究结论:结核分枝杆菌感染可下调巨噬细胞中METTL3的表达,进而下调其靶基因SOCS2 mRNA的m~6A水平,增强SOCS2 mRNA的稳定性,从而诱导巨噬细胞向M1方向极化。本研究首次揭示了m~6A修饰在巨噬细胞抗结核免疫中的作用,有助于加深对结核病免疫应答机制的理解。