论文部分内容阅读
目的:探究草乌甲素对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应的抑制作用;分析草乌甲素对LPS激发的RAW264.7巨噬细胞炎症模型抗炎作用的潜在分子机制。方法:使用不同浓度(分别为0、25、50、100、150、200、400、600、800、1000、1500μg/mL)的草乌甲素处理RAW264.7细胞24h,用细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(CCK-8)检测RAW264.7细胞活力并筛选草乌甲素对RAW264.7细胞活性的安全剂量范围。ELISA:将RAW264.7细胞随机分为正常对照组(NC组)、LPS组和LPS+BLA组。NC组:细胞不做任何处理;LPS组:用500 ng/mL的LPS刺激细胞;LPS+BLA组:均先加入安全剂量范围浓度的草乌甲素,再加入500ng/mL的LPS刺激细胞,在到达一定的药物作用时间后(分别为0.5、1、2、3、4、5、6、8、12、16、18、20、24、30、36、48h)停止培养并收取上清液,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α及巨噬细胞趋化蛋白-1(MCP-1)水平。Western blot:RAW264.7细胞随机分为NC组、LPS组和LPS+BLA组。NC组和LPS组处理同上,LPS+BLA组:均先加入安全范围浓度的草乌甲素,再加入500 ng/mL的LPS刺激细胞,在到达一定的药物作用时间后(分别为2、6、12、18、24h)停止培养并提取蛋白,Western blot法检测草乌甲素对LPS诱导的RAW264.7细胞中iNOS、COX2蛋白表达水平及对TLR4、NF-κB、MAPK信号通路分子活化的影响。结果:1.CCK-8结果显示草乌甲素的半抑制浓度(IC50)为197.4μg/mL,因此本实验选取安全范围内的150μg/mL的草乌甲素作为后续实验的浓度。2.ELISA结果显示,与NC组比较,LPS组RAW264.7细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6与MCP-1的含量显著升高(P<0.05);与LPS组相比,草乌甲素在各作用时间点均能有效降低RAW264.7细胞中炎症因子TNF-α和IL-1β的含量(P<0.05),其中草乌甲素在作用时间为30h时对TNF-α的抑制作用最明显(P<0.05);与LPS组相比,草乌甲素在大部分时间点均能有效降低RAW264.7细胞中炎症因子MCP-1和IL-6的含量(P<0.05)。3.WB检测结果显示,与NC组比较,LPS组RAW264.7细胞中iNOS、COX2以及TLR4、p-p65、p-p38、p-ERK和p-JNK的表达水平显著升高(P<0.05);与LPS组比较,2h、6h、12h、18h、24h组RAW264.7细胞中iNOS、COX2以及TLR4、p-p38、p-JNK的表达水平显著降低(P<0.05);6h、12h、18h、24h组RAW264.7细胞中p-p65的表达显著降低(P<0.05);12h、18h、24h组RAW264.7细胞中p-ERK的表达显著降低(P<0.05)。表明草乌甲素能显著抑制iNOS、COX2、TLR4的表达以及NF-κB和MAPK通路的活化;其中与其他各时间点比较草乌甲素作用时间24h时的抑制作用最明显(P<0.05)。结论:1.草乌甲素能够有效抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应。2.草乌甲素能够抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6与MCP-1和炎性蛋白iNOS、COX2的表达。3.草乌甲素可能通过抑制TLR4以及激活NF-κB和MAPK信号而发挥抗炎作用。