论文部分内容阅读
目的： 本实验通过构建Hsp90和Mcl-1不同结构域缺失突变体，利用免疫共沉淀技术鉴定Hsp90与Mcl-1分子相互作用的结构域，为进一步研究两者在结肠癌发生发展过程中的作用提供理论依据。 方法： 1.将本课题组前期构建好的Mcl-1缺失突变体载体转染HT-29细胞，通过免疫共沉淀技术鉴定Mcl-1蛋白中参与Hsp90与Mcl-1相互作用的结构域。 2.根据 Hsp90 的蛋白结构（N、C、M 3 个结构域）对应的基因序列，利用NCBI中的Primier-Blast设计引物，以人Hsp90cDNA为模板，采用PCR的方法，分别扩增上述3个结构域的Hsp90缺失突变体序列，并将扩增片段插入带HA-tag的真核表达载体 PcDNA3.1，从而构建不同的 Hsp90 缺失突变体载体，利用菌落PCR以及DNA测序鉴定缺失突变载体是否构建成功； 3. 将Hsp90缺失突变体载体转染HT-29细胞，通过免疫共沉淀鉴定Hsp90蛋白中参与Hsp90与Mcl-1相互作用的结构域。 结果： 1. 免疫共沉淀鉴定Mcl蛋白中参与Hsp90与Mcl-1相互作用的结构域：较空白组比，Mcl-1 PEST、BH1、BH3、CHT突变结构域不影响Mcl-1和Hsp90的相互作用，Mcl-1 BH2结构域突变后，使Mcl-1和Hsp90无法相互结合，故说明Mcl-1 BH2结构域可能是参与和Hsp90蛋白相互作用的主要结构域。 2. 根据设计的引物，PCR扩增的目的片段经琼脂凝胶电泳后，可观察到3条约1500bp左右大小的清晰特异性条带，与预计DNA片段大小相符。 3. 通过PCR扩增方法获得Hsp90的N、M、C 3个结构域缺失突变体。并用菌落PCR对Hsp90各结构域缺失突变体真核表达质粒进行鉴定，证实重组的缺失突变体载体构建正确；对构建的缺失突变体载体进行测序分析，与NCBI中的测序结果进行比对证实结果 3 个缺失突变体编码基因均分别被正确插入 pcDNA3.1表达载体中，即不同结构域Hsp90缺失突变体载体构建成功。 4. 免疫共沉淀鉴定Hsp90蛋白中参与Hsp90与Mcl-1相互作用结的构域：较空白组比，Hsp90 C、N突变结构域不影响Hsp90和Mcl-1的相互作用；Hsp90 M结构域突变后，使Hsp90和Mcl-1无法相互结合，故说明Hsp90 M结构域可能是参与和Mcl-1蛋白相互作用的主要结构域。 结论： 1.以Hsp90 cDNA为模板，通过PCR扩增载体构建获得pcDNA3.1-Hsp90-△N、pcDNA3.1-Hsp90-△C、pcDNA3.1-Hsp90-△M缺失突变体； 2.经菌落PCR、DNA测序鉴定Hsp90各结构域缺失突变体重组质粒构建成功； 3. Hsp90的M结构域和Mcl-1的BH2结构域可能参与两者的相互作用。