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目的:构建表达短发卡RNA(shRNA)的质粒载体,观察其在K-ras基因突变类型为GAT和GTT的人胰腺癌细胞株PANC-1和CFPAC-1间的交叉抑制效果,为RNAi技术应用于治疗胰腺癌奠定一定的理论和实验基础。方法:1、针对GAT和GTT两种K-ras基因突变类型,分别设计两条shRNA序列,并分别加载到质粒载体pGenesil-1上,构建针对人胰腺癌细胞株PANC-1和CFPAC-1的K-ras基因的质粒pGenesil-1GAT和pGenesil-1GTT。2、应用质粒pGenesil-1GAT和pGenesil-1GTT瞬时转染K-ras突变类型为GAT的人胰腺癌细胞株PCNA-1 ,同时将质粒pGenesil-1GAT和pGenesil-1GTT瞬时转染具有K-ras突变类型为GTT的人胰腺癌细胞株CFPAC-1。每种细胞分4组,分别为特异性抑制组,交叉性抑制组,空白质粒组和对照组,其中特异性抑制组转染同细胞K-ras基因突变类型相同的质粒,交叉性抑制组转染与其K-ras基因突变类型不同的质粒,空白对照组转染空白质粒pGenesil-1KB,对照组以1×PBS转染作为对照。用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹法(Western-blot)方法检测转染后细胞K-ras基因的表达情况,并采用CCK-8(ceIl counring kit-8)活细胞计数法,绘制转染前后细胞的生长曲线,以检测质粒pGenesil-1GAT对胰腺癌细胞PANC-1的K-ras基因的抑制效果和质粒pGenesil-1GTT对PANC-1细胞的交叉抑制效果,以及质粒pGenesil-1GTT对胰腺癌细胞CFPAC-1的K-ras基因的抑制效果和质粒pGenesil-1GAT对CFPAC-1细胞的交叉抑制效果。结果:1、通过酶切鉴定和送检基因测序证实插入shRNA序列正确,成功构建了质粒pGenesil-1GAT和pGenesil-1GTT。2、将质粒pGenesil-1GAT和pGenesil-1GTT瞬时转染到PANC-1细胞后,PANC-1特异性抑制组(转染pGenesil-1GAT的细胞)细胞的K-ras基因mRNA和蛋白表达水平明显下降,与交叉抑制组(转染pGenesil-1GTT的细胞)相比结果有显著性差异(p<0.05),与转染空白质粒组(转染pGenesil-1KB的细胞)相比结果有显著性差异(p<0.05),与对照组相比结果亦有显著性差异(p<0.05),细胞生长明显受限,对数生长期后移,平台期水平低,细胞生长曲线明显向右下移动,而PANC-1细胞交叉抑制组(转染pGenesil-1GTT的细胞)的K-ras基因mRNA和蛋白表达水平下降不明显,与转染空白质粒组(转染pGenesil-1KB的细胞)相比结果无显著性差异(p>0.05),与未转染的空白对照组最相比结果亦无显著性差异(p>0.05)。细胞生长未见明显影响。3、将质粒pGenesil-1GAT和pGenesil-1GTT瞬时转染到CFPAC-1细胞后,特异性抑制组(转染pGenesil-1GTT的细胞)K-ras基因mRNA和蛋白表达水平明显下降,与交叉抑制组(转染pGenesil-1GAT的细胞)相比结果有显著性差异(p<0.05),与空白质粒组(转染pGenesil-1KB的细胞)相比结果有显著性差异(p<0.05),与对照组相比结果亦有显著性差异(p<0.05),细胞生长亦明显受限。而交叉抑制组(转染pGenesil-1GAT的细胞)K-ras基因mRNA和蛋白表达水平下降不明显,与空白质粒组(转染pGenesil-1KB的细胞)相比结果无显著性差异(p>0.05),与对照组相比结果亦无显著性差异(p>0.05),细胞生长未受影响。结论:1、针对胰腺癌细胞K-ras基因突变位点设计的shRNA能够有效地加载到pGenesil-1质粒载体上,并且重构的质粒载体都可以高效的转染人胰腺癌细胞株PANC-1和CFPAC-1。2、突变特异性的shRNA可以特异性的抑制相应突变类型的K-ras基因的表达,从而达到抑制具有相应K-ras基因突变类型的人胰腺癌细胞生长的目的,说明K-ras基因在肿瘤细胞增殖方面起到非常重要的作用,因此应用RNA干扰技术治疗胰腺癌是可行的。3、针对K-ras突变类型GAT和GTT所设计的两条shRNA序列,无相互交叉抑制现象的出现,这说明质粒载体介导的RNAi特异性非常强,一般不会出现碱基错配现象,这为RNAi应用于胰腺癌的基因治疗提供了更加全面的数据。