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研究背景肿瘤新生血管生成对于肿瘤的发生,发展以及转移具有十分重要的意义。多种抗肿瘤药物以肿瘤新生血管生成为治疗靶点,但是肿瘤细胞及微环境失去了正常调控,致使肿瘤新生血管多方面都表现出异常,管壁发育幼稚、内皮细胞连接不紧密、基底膜缺失以及周细胞疏松等血管壁功能不全,导致血管壁通透性高、孔隙增多、渗出增加、细胞间质液压增加,进一步加剧细胞微环境的缺氧和酸性环境,影响肿瘤细胞对药物摄取,对治疗十分不利。一些肿瘤药物以抗肿瘤血管生成为治疗靶点,但由于上述原因,抗肿瘤药物单独使用疗效有限,且全身毒副作用明显,因此各种联合治疗已逐渐成为新的趋势。课题组前期研究发现,脉冲式高声压(>4MPa)治疗超声激励微泡空化能够利用机械作用损毁肿瘤微血管,并且明显阻断肿瘤内部血流灌注,这可能成为一种物理性的抗血管治疗方法,但该方法带来的血流阻断效应是可逆性的,一般在治疗24小时后肿瘤血流即会逐渐恢复。已有研究表明,超声诱导微泡空化时,可形成声孔增加肿瘤细胞通透性,降低组织间隙液压,正常化肿瘤微血管,使化疗药物的递送和释放更为有效。同时,超声激励的微泡空化和以血管内皮为靶点的化疗药物均会对肿瘤微血管产生毁损或抑制作用,联合这两种治疗方式可将空化的物理性血管毁损效应和化疗药物的生物性抗血管作用协同起来,以期达到更理想的抗肿瘤新生血管生成的作用。研究目的本研究设想将超声激励微泡空化的肿瘤血流阻断效应联合静脉注射恩度注射液的抑制血管生成效应联合应用于治疗大鼠Walker-256肿瘤,验证该联合疗法对于肿瘤的血流灌注和血管新生能否产生快速且持续的阻断效应。材料与方法1.主要实验仪器CZ-960脉冲式超声空化治疗仪(索尼克电子有限责任公司,绵阳)具有弱聚焦式、单阵元圆形换能器,中心频率831k Hz,峰值负压4.3MPa。VINNO70彩色多普勒超声诊断仪(飞依诺科技有限公司,苏州),X4-12L高频线阵探头(频率4-12MHz)。超声造影选用CBI模式,机械指数为0.08。2.主要实验试剂Sonazoid~?注射用全氟丁烷微球(GE医疗,挪威),平均直径为2.1μm,以4ml生理盐水复溶16μl微球,微球溶液浓度约6×10~8/ml。重组人血管内皮抑制素注射液(恩度,15mg:3ml,2.4×10~5 U,山东先声麦得津生物制药有限公司,烟台)。3.实验动物60只健康雄性SD大鼠,8周龄,体质量180-200g。4.实验方法(1)大鼠Walker-256皮下移植模型建立:人乳腺癌肉瘤Walker-256细胞培养至细胞浓度约1×10~7/ml,取细胞悬液0.2 ml接种于大鼠一侧大腿内侧皮下。(2)实验分组及处理:将荷瘤大鼠随机分为4组,微泡+超声辐照+恩度组(Endostar+MEUS,n=15),恩度组(Endostar,n=15),微泡+超声辐照组(MEUS,n=15),超声假照组(Sham US,n=15)。治疗前造影结束后,微泡超声恩度组按照5mg/kg剂量经尾静脉注射恩度溶液,随后对肿瘤区域进行超声辐照5分钟,辐照同时经尾静脉缓慢注射1ml Sonazoid~?微球稀释液,注射结束后跟注0.5ml生理盐水冲管。恩度组按照5mg/kg剂量注射恩度溶液,随后注射1.5ml不含微泡的生理盐水,不进行超声辐照。微泡超声组按照微泡超声恩度组的方式,对肿瘤区域进行超声辐照5min,进行超声辐照同时经尾静脉缓慢注射1ml Sonazoid~?微球稀释液,不注射恩度溶液。超声假照组仅注射1.5ml生理盐水,将治疗探头置于肿瘤区域但不进行辐照。上述治疗过程每日一次,连续三日。(3)二维超声及超声造影检查:从首次治疗开始的连续7天内每天进行二维超声检查,测量肿瘤径线,计算肿瘤体积。分别于首次治疗前,末次治疗后1天,末次治疗后4天进行超声造影检查,对各组肿瘤动态造影影像进行定量分析处理,评估肿瘤血流灌注情况。(4)组织学检查:末次造影结束后,剥离肿瘤组织,固定、石蜡包埋、切片。行VEGFA、CD31、CD34免疫组织化学染色,分别计数肿瘤微血管密度。利用TUNEL法检测试剂盒进行凋亡指数分析。部分标本经处理后进行透射电镜观察。结果(1)治疗前,各组PI和AUC无统计学差异(p>0.05)。治疗后1天,微泡超声恩度组PI和AUC显著低于其余三组,恩度组和微泡超声组显著低于假照组(p<0.001)。治疗后4天,微泡超声恩度组PI和AUC显著低于其余三组,恩度组显著低于假照组(p<0.001)。(2)治疗前各组肿瘤体积无统计学差异。治疗后1天,微泡超声恩度组肿瘤体积明显低于其余三组,恩度组和微泡超声组明显低于假照组(p<0.001)。治疗后4天,微泡超声恩度组肿瘤体积明显低于其余三组,恩度组也略低于假照组(p<0.001)。(3)微泡超声恩度组的肿瘤组织在CD31、CD34和VEGFA表达水平上,显著低于其余各组,恩度组则仅在VEGFA表达水平上低于假照组,而微泡超声组在CD31和CD34表达水平上较假照组也更低(p<0.001)。(4)微泡超声恩度组和微泡超声组的细胞凋亡指数明显高于B组和D组(p<0.001),而恩度和假照组之间凋亡指数无显著差异(p>0.05)。(5)透射电镜下观察各组肿瘤组织,假照组可见肿瘤血管内皮细胞结构完整,微泡超声恩度组和微泡超声组肿瘤组织可见微血管结构不连续,核固缩及线粒体空泡。结论超声激励微泡空化联合恩度治疗可显著减少大鼠Walker-256肿瘤血流灌注,抑制肿瘤新生血管生成及肿瘤生长。