【摘 要】
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目的:探究靶向NLRP3的miRNA在内皮细胞中的功能和机制,为防治动脉粥样硬化提供新策略。方法:（1）使用四个在线生物信息学网站（Targetscan,miRanda,miRWalk,miRmap）通过综合评估网站预测分数,miRNA保守性及与心血管炎症的相关性,筛选出4个靶向NLRP3的潜在miRNAs,即miR-302c-3p、miR-490-5p、miR-421和miR-876-5p。（2
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目的:探究靶向NLRP3的miRNA在内皮细胞中的功能和机制,为防治动脉粥样硬化提供新策略。方法:（1）使用四个在线生物信息学网站（Targetscan,miRanda,miRWalk,miRmap）通过综合评估网站预测分数,miRNA保守性及与心血管炎症的相关性,筛选出4个靶向NLRP3的潜在miRNAs,即miR-302c-3p、miR-490-5p、miR-421和miR-876-5p。（2）通过实时定量逆转录聚合酶反应（qRT-PCR）、荧光原位杂交实验（FISH）检测人正常血管组织和动脉粥样硬化血管组织候选miRNA差异性表达;（3）采用氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）处理的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）作为体外细胞模型。分别过表达和敲低miR-302c-3p,采用qRT-PCR、蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）实验检测焦亡相关蛋白（NLRP3、cleaved-caspase-1、cleaved-IL-1β和GSDMD）表达量;（4）采用乳酸脱氢酶（LDH）释放实验和Hoechst 33342/PI染色检测细胞焦亡情况;（5）磁珠法RNA下拉（pull down）实验、双荧光素酶报告基因实验（Dual luciferase reporter gene assay）验证miR-302c-3p与NLRP3的直接靶向关系;（6）si RNA沉默NLRP3表达,同时转染miR-302c-3p mimic和inhibitor,探究NLRP3的沉默是否影响miR-302c-3p对细胞焦亡的抑制作用。（7）构建动脉粥样硬化小鼠模型,尾静脉注射miR-302c-3p激动剂（miR-302-3p agomir）治疗后,采用油红染色、免疫荧光、免疫组化、RNA荧光原位杂交、qRT-PCR、蛋白质免疫印迹（western blot）实验检测细胞焦亡相关蛋白和miR-302c-3p的表达量。结果:（1）miR-302c-3p在人动脉粥样硬化斑块组织和ox-LDL处理的HUVECs中表达下调,并且与NLRP3炎性小体激活相关的细胞因子（NLRP3、cleaved-caspase-1、cleaved-IL-1β和GSDMD）呈负相关（P<0.05）。（2）pull down实验、双荧光素酶报告基因实验证实miR-302c-3p可靶向NLRP3特定位点并抑制其转录表达（P<0.05）。进一步功能实验表明,过表达miR-302c-3p可抑制NLRP3、cleaved-caspase-1、cleaved-IL-1β和GSDMD的表达,减少细胞焦亡数量（P<0.05）;而抑制内源性miR-302c-3p表达则会上调NLRP3、cleaved-caspase-1、cleaved-IL-1β和GSDMD的表达,增加细胞焦亡数量（P<0.05）。（3）过表达或敲低miR-302c-3p表达的同时沉默NLRP3表达可进一步下调NLRP3、cleaved-caspase-1、cleaved-IL-1β和GSDMD的表达,减少细胞焦亡数量（P<0.05）。（4）动物实验结果显示:与疾病组相比,治疗组脂质区域减少,动脉粥样硬化病变有所改善,并且NLRP3、cleaved-caspase-1、cleaved-IL-1β和GSDMD的表达被下调（P<0.05）。结论:体内和体外实验证明miR-302c-3p通过靶向NLRP3特定位点抑制NLRP3表达,进而抑制内皮炎症和细胞焦亡。过表达miR-302c-3p可抑制内皮细胞焦亡改善动脉粥样硬化,提示其可作为防治动脉粥样硬化的一种新靶点。
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