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内质网是分泌蛋白合成和加工的工厂,内质网稳态一旦紊乱,将会影响蛋白质折叠并引起内质网应激。哺乳动物细胞的内质网可以感受这种应激并适时的作出应答,主要通过两条路径:一,通过PERK-eIF2α路径调控蛋白质翻译的衰减,降低新蛋白质的合成来预防异常未折叠蛋白和错误折叠蛋白的进一步积累;二,转录激活内质网伴侣蛋白基因,如GRP78和GRP94。为了应答不同的环境刺激,eIF2α磷酸化抑制总体蛋白翻译。但同时会有一个例外,那就是优先翻译ATF4,它是一种控制关键基因转录、适应内质网功能的主要调控者。ATF4是ATF/CREB家族成员,是一种含碱性区-亮氨酸拉链的应激反应蛋白,也是一种可以通过调控UPR标靶基因(包括GRP78和GRP94)的转录来调控细胞适应内质网应激的保护性蛋白。GRP78和GRP94是内质网伴侣亚家族中的葡萄糖调节蛋白(GRP)家族成员,是一种散布在内质网腔中为了顺应内质网应激状态所产生的一类应激蛋白。GRP也是内质网中重要的标志性分子伴侣,参与蛋白质折叠、装配与转运。我们发现草鱼ATF4(CiATF4)与GRP78、GRP94协同,在应答细胞应激时参与了相似的任务。在37℃热激条件下,CiATF4的表达趋势近似于CiGRP78和CiGRP94。即,CiATF4的表达也会被二次上调,分别是在热激2h时和热激6h后再放回28℃恢复18h时。当草鱼ATF4与GRP78、GRP94处于相同应激时,有相同的表达趋势,这就暗示,CiATF4极可能会协助CiGRP78和CiGRP94应答细胞应激反应。而哺乳动物中已报道ATF4在应激反应中作为一种关键的激活转录因子可以调控内质网伴侣分子的转录促使细胞适应内质网应激,更为我们的猜测提供了理论依据。为了探索草鱼ATF4调控CiGRP78和CiGRP94的转录激活,我们同源克隆CiATF4的开放阅读框。利用大肠杆菌BL21表达CiATF4,并用镍柱亲和层析法纯化。同时,在实验室原有克隆CiGRP78和CiGRP94cDNA的基础上,用基因步移法克隆了它们的启动子序列。经分析CiGRP78和CiGRP94启动子都具有一个多重拷贝的CCAAT(N9)CCACG(N代表一个9bp区域)ER应激元件(ERSE),其侧翼有GC富集。ERSE元件对于未折叠蛋白反应(UPR)的激活是必需的。除此之外,CiGRP78启动子有1个典型的TATA盒(-26)和3个CCAAT盒(-64,-97,-187),2个Sp1(transcription factor specificity protein1)结合位点(-325,-656),1个TFIID (transcription factor IID)结合位点(-462),1个YY1(Yin-Yang-1)结合位点(-368),一个CARE结合位点(-757)和2个CREB结合位点(-30,-152)。其中CRE和CARE结合位点是ATF4潜在的结合位点,但二者并未出现在CiGRP94启动子中。CiGRP94启动子中含有一个TATA盒(-53)和2个CCAAT盒(212,-435),一个YY1结合位点(-599)和2个NF-Y (nuclear factor Y)结合位点(-90,-205)。体外凝胶阻滞实验分析发现CiATF4对CiGRP78和CiGRP94的启动子有高亲和性。相对于对照组,体外重组表达的CiATF4对CiGRP78和CiGRP94的启动子片段组的迁移速度有明显的阻滞作用,而且,这种阻滞作用随着CiATF4蛋白的浓度增加而增强。这说明CiATF4能直接结合于CiGRP78和CiGRP94的启动子,有调节CiGRP78和CiGRP94转录的潜能。为了验证CiATF4在体内的功能,我们构建重组质粒pGL3-CiGRPs和pcDNA3.1-CiATF4,并将它们瞬时共转染至草鱼肾(CIK)细胞。再通过荧光素酶分析检测CiATF4对CiGRP启动子序列报告基因的影响。结果发现CiATF4能够极大地激活荧光素酶报告基因的活性,证明了CiATF4可以激活CiGRP78和CiGRP94的转录。而且,为了更好的理解CiATF4调控CiGRP转录激活的分子机制,我们构建了三个包含不同功能元件的CiGRP78启动子突变的重组质粒(即:CARE-mut/LUC, CRE1-mut/LUC and CRE2-mut/LUC)并与CiATF4瞬时共转染至草鱼肾细胞。结果显示CRE和CARE元件都是CiGRP78转录激活的调控元件,在CiATF4的刺激中起重要作用,其中,CRE元件发挥更大的作用。