【摘 要】
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目的:本论文期望制备α-芋螺毒素均一抗原或偶联载体抗原以制备高中和活性抗血清,为α-芋螺毒素中毒救治提供手段,此外发现新的作用于GABABR介导的Cav2.2的α-芋螺毒素。方法:本论文尝试通过三种方法制备MI或GI新的免疫抗原:第一是通过基因工程方法设计了一种融合α-芋螺毒素GI基因、PADRE基因和破伤风毒素C片段基因（TTC）的原核表达载体,并实现了重组蛋白的表达与纯化得到重组蛋白;第二是利
【基金项目】
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重点研发计划:剧毒芋螺毒素MI抗血清的制备及评价,项目编号:2019YFC0312605
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目的:本论文期望制备α-芋螺毒素均一抗原或偶联载体抗原以制备高中和活性抗血清,为α-芋螺毒素中毒救治提供手段,此外发现新的作用于GABABR介导的Cav2.2的α-芋螺毒素。方法:本论文尝试通过三种方法制备MI或GI新的免疫抗原:第一是通过基因工程方法设计了一种融合α-芋螺毒素GI基因、PADRE基因和破伤风毒素C片段基因（TTC）的原核表达载体,并实现了重组蛋白的表达与纯化得到重组蛋白;第二是利用化学合成方法先合成含炔基MI或GI线性肽,然后通过点击反应合成多分支肽;第三是在MI的序列中引入游离半胱氨酸,然后与BSA偶联;最后将制备的免疫原免疫BALB/c小鼠制备抗血清,测定血清的抗体滴度及其中和活性。此外,合成了一些新型α-芋螺毒素及其他一些作用于GABABR介导的Cav2.2的α-芋螺毒素N端苯甲酰化突变体,并通过膜片钳技术测定了其对GABABR介导的Cav2.2的抑制活性。结果:（1）构建了表达α-芋螺毒素GI与PADRE、TTC融合蛋白的大肠杆菌原核表达载体,表达纯化了该重组蛋白抗原GI-PADRE-TTC。（2）应用点击反应合成并纯化了MI、GI多分支肽抗原。（3）GI-PADRE-TTC蛋白第四次和第五次免疫后,抗体滴度均大于1:25600,而单独的PADRE-TTC载体蛋白抗血清未检测到阳性,中和活性结果显示100、200μl GI-PADRE-TTC蛋白抗血清对40μg/kg GI中毒小鼠的保护率为14.3%、25.0%,且小鼠死亡时间显著延长。（4）20μg/只剂量的N端连接的MI八分支肽第4次免疫后血清抗体滴度为1:6400,10、20μg/只剂量的C端连接MI八分支肽第4次免疫后血清抗体滴度为1:3200及1:25600,C端连接的GI多分支肽50μg/只第4次免疫后滴度仅为1:800,但上述GI或MI多分支肽免疫血清对MI（20μg/kg）、GI（40μg/kg）中毒小鼠无明显保护活性。（5）在MI的序列中引入游离半胱氨酸,线性肽折叠形成多种产物,无法得到含游离半胱氨酸MI与BSA偶联制备抗原;（6）合成了15条α-芋螺多肽并测定了其对GABABR介导的Cav2.2的抑制活性,结果发现:10μM浓度的Bt14.10、Bt14.14、Lt1.1、Liuna-7-I、和Liuna-7-II、Lt1.2、Liuna-18-I对GABABR介导的Cav2.2抑制活性低（11.28%～20.31%）,10 n M Benzoyl-Rg IA、Benzoyl-Pe IA、Benzoyl-Pe IA[S9R]以及Benzoyl-Au IB-I以及Benzoyl-Au IB-II对GABABR介导的Cav2.2具有较高活性,抑制率分别为23.29±2.28%、17.72±2.73%、17.27±2.08%、24.92±2.51%及24.19±3.04%。未改造毒素的抑制活性正在测定中。结论:本论文探索了新型剧毒α-芋螺毒素MI和GI免疫抗原的制备方法,并对其制备的抗血清的中和活性进行了评价。实验结果表明:GI-PADRE-TTC融合蛋白抗血清对GI起到部分抗毒活性而GI和MI多分支抗原肽制备的抗血清不能保护中毒小鼠,另外,含游离半胱氨酸MI折叠产物无主峰,不能进行纯化及与BSA偶联。另一方面,我们也合成并测定了几种新型α-芋螺毒素对GABABR介导的Cav2.2的抑制活性。10μM浓度的新型毒素对GABABR介导的Cav2.2抑制活性均较弱,Rg IA和Au IB的N端苯甲酰化后突变体的活性仍很高。
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