【摘 要】
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目的:通过建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型模拟缺血性脑卒中,采用龙蛭汤、丁苯酞、内质网应激阻断剂等方法干预,观察龙蛭汤对模型大鼠神经功能评分、脑组织病理学变化、脑梗死体积、微血管密度计数以及GRP78、CHOP mRNA和蛋白表达的影响,从内质网应激角度探讨龙蛭汤促进脑缺血再灌注损伤后血管新生的作用机制。方法:（1）第一部分:24只SD大鼠随机分为4组,假手术组（生理盐水+假手术）、脑缺血再灌注24
【基金项目】
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项目名称:基于内质网应激-自噬探讨龙蛭汤促进缺血性脑损伤大鼠血管新生作用,项目合同编号:81560790,项目来源:国家自然科学基金,项目起止时间:2016.01—2019.12
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目的:通过建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型模拟缺血性脑卒中,采用龙蛭汤、丁苯酞、内质网应激阻断剂等方法干预,观察龙蛭汤对模型大鼠神经功能评分、脑组织病理学变化、脑梗死体积、微血管密度计数以及GRP78、CHOP mRNA和蛋白表达的影响,从内质网应激角度探讨龙蛭汤促进脑缺血再灌注损伤后血管新生的作用机制。方法:（1）第一部分:24只SD大鼠随机分为4组,假手术组（生理盐水+假手术）、脑缺血再灌注24h组（生理盐水+造模）、脑缺血再灌注3d组（生理盐水+造模）、脑缺血再灌注7d组（生理盐水+造模）,每组6只。除了假手术组外,其余3组均采用改良Longa线栓法建立右侧脑局灶性缺血再灌注损伤大鼠模型。（1）分别于术后24h、3d、7d对相应组大鼠进行神经功能评分;（2）于术后24h、3d、7d分别取相应组大鼠脑组织,用RT-PCR法比较各组GRP78和CHOP mRNA表达;（2）第二部分:108只大鼠随机分为6组,假手术组（生理盐水+假手术）、模型组（生理盐水+造模）、丁苯酞组（丁苯酞+造模）、龙蛭汤组（龙蛭汤+造模）、4-PBA组（即内质网应激阻断剂组,4-PBA+生理盐水+造模）、4-PBA+龙蛭汤组（4-PBA+龙蛭汤+造模）,每组12只。（1）术后第3天对各组大鼠进行神经功能缺损评分;（2）采用2,3,5-氯化三苯四氮唑（TTC）染色法测定脑梗死体积;（3）苏木精-伊红（HE）染色观察海马区脑组织病理形态变化;（4）采用RT-PCR法比较各组GRP78和CHOP mRNA表达;（5）采用免疫组织化学染色法测定脑梗死区微血管密度计数MVD;（6）采用免疫印迹法（Western Blot）检测各组大鼠内质网应激相关蛋白GRP78和CHOP的表达。结果:（1）第一部分:（1）与假手术组相比,各缺血再灌注组大鼠神经功能显著缺损评分均有不同程度提高（P<0.05）,且脑缺血再灌注3d组大鼠神经功能缺损评分最高（P<0.05）;（2）与假手术组相比,其余各组大鼠脑组织的GRP78和CHOP mRNA相对表达量均明显升高,并于脑缺血再灌注3d时达峰值（均P<0.05）;（2）第二部分:（1）龙蛭汤组、丁苯酞组、4-PBA组、4-PBA+龙蛭汤组的神经功能缺损评分与模型组相比,均有明显降低（P<0.05）,且龙蛭汤组、丁苯酞组相比无明显差异（P﹥0.05）,而假手术组未见明显神经功能缺损症状;（2）假手术组大鼠脑组织被TTC染料染成均匀的深红色,其余各组大鼠脑组织均呈现出不同程度的灰白色脑梗死灶,与模型组相比,龙蛭汤组、丁苯酞组大鼠脑梗死体积百分比显著降低（P<0.05）;与龙蛭汤组相比,4-PBA组脑梗死体积明显较大（P<0.05）,丁苯酞组与龙蛭汤组相比无明显差异（P﹥0.05）;（3）光镜下,假手术组大鼠脑组织神经细胞形态结构基本正常,其余各组大鼠脑组织神经细胞均有不同程度的缺血性坏死,其中模型组神经细胞为缺血性坏死严重,龙蛭汤组、丁苯酞组、4-PBA+龙蛭汤组均呈轻度缺血性坏死,4-PBA组呈中度缺血性坏死;（4）模型组大鼠脑组织中GRP78和CHOP mRNA相对表达量与假手术组相比,均有不同程度升高（P<0.05）;与模型组相比,龙蛭汤组、丁苯酞组GRP78和CHOP mRNA相对表达量显著降低（P<0.05）;与龙蛭汤组相比,4-PBA组GRP78和CHOP mRNA相对表达量较高（P<0.05）、4-PBA+龙蛭汤组与龙蛭汤组相比无明显差异（P﹥0.05）;（5）各手术组大鼠脑组织的微血管密度均比假手术组的高（P<0.05）;与模型组相比,龙蛭汤组、丁苯酞组、4-PBA+龙蛭汤组微血管密度明显较高（P<0.05）;与龙蛭汤组相比,4-PBA组显著较低（P<0.05）;（6）Western Blot结果显示,模型组大鼠GRP78和CHOP蛋白表达量均比假手术组的高（P<0.05）;与模型组相比,龙蛭汤组、丁苯酞组、4-PBA组、4-PBA+龙蛭汤组的GRP78和CHOP蛋白表达量均有明显的降低（P<0.05）。结论:（1）龙蛭汤可能通过下调内质网应激相关因子GRP78和CHOP的表达以抑制大鼠脑组织过度的内质网应激反应,进而改善脑组织缺血坏死等情况,发挥脑保护作用;（2）龙蛭汤抑制脑缺血再灌注大鼠血管内皮细胞的内质网应激反应可能是其促进血管新生的作用机制之一。
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