水稻ERG4_ERG24家族TS1基因的功能研究

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水稻(Oryza sativa.L)是最主要的粮食作物,世界上超过一半的人口以稻米为主粮。而株型是影响水稻产量的重要因素,理想株型能大幅度提高水稻产量,因此克隆与鉴定水稻株型相关基因,完善水稻株型形成的分子调控网络,对于水稻株型定向设计改良和水稻高产育种具有十分重要的意义。前期我们通过水稻株型基因芯片筛选得到一个候选基因TS1,为探讨TS1基因的生物学功能,我们利用CRISPR/Cas9技术定向编辑TS1基因,并进行了生物信息学分析、表达模式分析、亚细胞定位、互作蛋白筛选及验证、RNA-seq等研究,具体研究结果如下:(1)从水稻基因组中鉴定到 3个ERG4ERG24家族基因,TS1、Os25189和Os22650。家族成员之间的等电点、疏水性和稳定系数相似,基因结构和基序分布保守性高;ERG4ERG24家族基因存在明显的单双子叶分化;其启动子区域含有大量光和激素响应顺式作用元件,表明ERG4ERG24家族基因可能参与水稻生长发育的调控。(2)成功构建了TS1敲除载体pYLCRISPR/Cas9-MT-TS1,并获得6株T0代阳性转基因植株;突变类型主要为缺失突变,突变长度主要为小片段(<12bp),突变位置主要在PAM结构上游第3碱基处;TS1突变体株高降低、穗长变短、单穗粒数减少,单株产量下降,而有效分蘖、千粒重等其他农艺性状无明显变化;创制的突变体表型是可遗传的,且后代符合经典孟德尔遗传规律。(3)qRT-PCR结果表明TS1基因在根、茎、叶、不同发育时期的穗均有表达,在根、茎、穗发育Ⅵ期表达量较高,进一步利用GUS基因报告系统进行验证,结果与qRT-PCR基本一致,这表明TS1在水稻中是组成型表达。(4)亚细胞定位结果显示,TS1属于非典型的叶绿体定位蛋白。在含有叶绿体的水稻原生质体中定位于叶绿体,而在不含叶绿体的水稻原生质体中定位于细胞质。(5)通过酵母双杂交技术筛选到6个TS1候选互作蛋白,进一步通过点对点阳性验证、双分子荧光互补验证及蛋白共定位验证,表明ClpP与TS 1存在互作,暗示可能在叶绿体共同参与水稻株型的调控。(6)ts1突变体由营养生长期向生殖生长期转化过程中茎节的转录组数据分析结果表明,大量差异表达基因富集在能量储备代谢、糖原合成代谢途径、激素响应等途径。TS1基因的克隆与生物学功能解析,为阐明水稻株型形态建成机制及调控网络提供了理论基础,同时为“理想株型育种”提供了新的靶标基因与遗传材料。
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