本研究从血清学和分子生物学两个方面建立了汉坦病毒和登革病毒诊断方法。 一、化学发光酶联免疫分析法(CLEIA)检测汉坦病毒IgM抗体。在MacELISA的基础上建立了化学发光酶联免疫分析(CLEIA)法，该方法以抗人IgM-μ链包被黑色不透明聚乙烯96孔酶标板，配以辣根过氧化物酶标记肾综合征出血热核蛋白抗原作为检测抗原以及luminol-H<,2>O<,2>作为发光底物。与MacELISA进行比较表明，CLEIA法对发病后1天至17天的HFRS病人血清IgM抗体检测灵敏度达100％，高于MacELISA。CLEIA法检测IgM抗体对正常人血清无非特异性反应，特异度为100％。CLEIA的变异程度与MacELISA变异程度相当，都在临床检测可接受的范围内。CLEIA是一种灵敏、特异、稳定的方法，适用于HFRS早期病人IgM抗体的检测。 二、汉坦病毒酶联免疫微量中和试验方法的建立。空斑减少中和试验是汉坦病毒分型诊断的经典方法，但是该方法所需要的操作周期长，影响因素多，成功率较低。酶联免疫微量中和试验已经成功地用于其他多种病毒的检测，微量中和试验检测汉坦病毒中和抗体在国内外尚未见报道。 本研究以以汉坦病毒中国流行株84FLi，L99作为攻击病毒分别与系列稀释的待检血清4℃中和过夜，次日将消化好的Vero-E6细胞加入中和过夜的细胞培养板，37℃，CO<,2>孵箱培养7天，以辣根过氧化物酶标记的组特异性单抗L133F3检测病毒感染情况，确定中和抗体滴度，进行分型。该方法和空斑减少中和试验检测结果高度相关。对96份HFRS病人血清和4份汉坦病毒免疫动物血清进行了微量中和试验分型检测，结果与所报道的类型相符。以上研究表明，酶联免疫微量中和试验是一种简便，灵敏，稳定的方法，对于有大量标本需要检测的流行病学调查和疫苗评价尤为适用。 三、汉坦病毒实时定量TaqMan探针一步法RT-PCR分型诊断方法的建立。近年新发展起来的实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)方法使得病毒分型更为简捷。 本研究根据汉坦病毒S片段序列设计了分型引物及探针，建立汉坦病毒实时定量TaqMan探针一步法RT-PCR分型诊断方法。该方法对于汉滩型和汉城型病毒的检出限可达3PFU，对于普马拉型病毒的检出限为6PFU。特异性分析证明该套探针和引物具有型特异性，对于1-4型登革病毒，麻疹病毒，黄热病毒也未出现非特异扩增。证明该方法灵敏，特异。 四、登革病毒实时定量TaqMan探针RT-PCR分型诊断方法的建立。登革病毒感染的及早诊断，特别是定量，分型诊断，对于临床病例的治疗以及疾控工作有重要意义，实时定量RT-PCR方法的出现可以很好地解决这一问题。 本研究对Genbank所能获取的登革病毒全基因序列和部分序列使用Bioedit软件进行比对，设计了登革病毒分型TaqMan探针及各型相应的引物，建立了登革病毒实时定量TaqMan探针RT-PCR分型诊断方法。以1-4型登革病毒使用随机引物反转录产生的cDNA为模板分别扩增四段包含各型目的扩增片段在内的800bp左右的片段作为评价检测限的模板。使用梯度稀释的PCR产物作为模板对各型引物和探针的检测限进行评价，结果各型引物和探针均能检测到2个拷贝。特异性分析证明该套探针和引物具有型特异性，对于汉坦病毒和麻疹病毒也未出现非特异扩增。证明该方法灵敏，特异。