本实验拟在体外培养SD大鼠MSCs，用荧光染料CM-DiI标记后经尾静脉移植入DMD模型mdx鼠，观察MSCs移植后向骨骼肌以及心肌的迁移及分化情况，并了解细胞移植后肌组织的病理学及膈肌功能学的改变情况；同时了解mdx鼠各个组织的MCP-1的表达以及rMSCs的MCP-1受体CCR-2的表达情况，最后进行体外的细胞迁移实验，了解mdx鼠肌组织在体外能否定向迁移rMSCs，阻断MCP-1后rMSCs的定向迁移是否受阻，以了解MCP-1是否是rMSCs的定向迁移因子。通过上述实验拟探讨rMSCs向mdx鼠病变肌组织定向迁移的机制，为MSCs移植最终应用于临床实验提供理论基础。 材料和方法 1实验动物 雄性SD大鼠(60-80g)20只作为供体鼠。mdx鼠(8周)60只(雌性54只，雄性6只)，分别进入细胞移植组、迁移因子检测组和空白对照组；正常C57鼠18只(8-20w，雌性15只，雄性3只)作正常对照。对8周龄mdx进行尾静脉MSCs移植，空白对照给予单纯培养基注射，分别于移植后4周、8周、12周取材；对移植后12周的mdx进行膈肌电生理检测；用8wmdx鼠及C57鼠进行MCP-1检测。细胞移植各组中死亡的mdx鼠退出试验，保持各组、各时间点动物为6只。 2实验方法 2.1rMSCs的分离培养和鉴定 应用L-DMEM培养SD大鼠骨髓干细胞，贴壁法分离、扩增及纯化rMSCs，并进行表面抗原鉴定，将形态一致的第5代(P5)rMSCs用于移植。 2.2CM-Dil标记MSCs 取生长良好的p5代细胞用0.25％胰酶消化，PBS重悬，调整细胞密度为1.0×106/ml，分别以终浓度为1uM、1.5uM和2uM的终浓度摸索最佳标记剂量。选取最佳浓度，观察荧光标记对该细胞生长的影响及体外荧光持续的情况。 2.3MSCs的移植 对8周龄的mdx鼠在移植前3天给予7.0Gy的亚致死量全身放疗，将CM-DiI标记的MSCs经尾静脉注入mdx鼠，移植细胞数量为1X107/只。空白对照给予无血清L-DMEM注射。 2.4MSCs移植后肌肉组织病理检测 分别取移植后不同时间点及对照组鼠腓肠肌、膈肌、心肌的冰冻切片进行常规HE染色，在镜下观察细胞形态，每张切片X200倍随机取6个视野，计数核中心移位的肌纤维(CNF)数目，并计算其比例。 2.5MSCs移植后肌组织dystrophin表达测定 取移植后不同时间点及对照组鼠的腓肠肌、膈肌、心肌进行冰冻切片做免疫荧光染色、RT-PCR和WesternBlot，检测dystrophin的表达情况，并同时检测CM-DiI的荧光情况以确定dystrophin阳性肌纤维来源。 2.6MSCs移植后膈肌收缩力的检测 取移植后3个月的mdx鼠及同龄对照组小鼠的膈肌进行收缩力电生理检测，以了解细胞移植治疗后mdx小鼠膈肌的运动功能是否有所改善。 2.7mdx鼠腓肠肌、膈肌、心肌组织的MCP-1表达检测 取放疗与不放疗的8w龄mdx鼠各6只、C57鼠6只，分别取其腓肠肌、膈肌、心肌组织进行冰冻切片作免疫荧光染色、Westernblot检测，了解MCP-1的表达情况。 2.8MSCs的CCR-2表达的检测 取培养至P5、P6、P7代的MSCs进行CCR-2的流式细胞、Westernblot检测，了解CCR-2的表达情况。 2.9细胞迁移实验 研究对象主要为P5代MSCs，取放疗与不放疗的8w龄mdx鼠、C57鼠的腓肠肌、膈肌、心肌匀浆液进行MSCs的迁移实验，使用目前国际普遍应用的Transwell培养板，另设MCP-1抗体阻断组、CM-DiI标记组以及P7代MSCs组。 结果 1MSCs的形态学、生长特点、表面标记物的检测 1.1MSCs的形态学与生长特点 以差速贴壁法原代培养的大鼠骨髓细胞，贴壁细胞多呈梭形或成纤维状，间有宽大扁平的不规则形、三角形或多角形，体积明显比悬浮细胞大，细胞核多呈卵圆形，位于胞质中央，悬浮细胞一般经3-4次换液后可去除。经3次传代后的MSCs趋于纯化，多数呈均一典型的“纺锤状”成纤维样细胞形态，细胞间排列呈“旋涡状”、“辐射状”或“栅栏状”，周边出现无细胞生长区。一般应用P5代细胞作后续试验。 1.2MSCs的表面标记物的检测 经流式细胞检测，MSCs表面CD11b(髓系淋巴细胞表面抗原Mac1)和CD45(泛白细胞标志抗原)检测阴性，而CD29(整合素家族类抗原标志分子VLAβ)和CD44(黏附分子家族类抗原标志分子HCAM)表达阳性。 2CM-Dil体外标记MSCs以CM-DiI不同浓度标记发现CM-DiI浓度为2uM时标记率＞98％，与1uM/L、1.5uM/L有显著差异(P＜0.05)。以2uM浓度标记的细胞其生长特点较未标记细胞无异，体外连续传代3次后仍可保持荧光。 3MSCs移植后mdx鼠的肌肉组织病理检测 正mdx鼠心肌在治疗前与治疗后的形态学均同C57鼠无显著差异，细胞排列紧密，未见炎性浸润等异常。 4MSCs移植后mdx鼠的dystrophin表达变化 4.1腓肠肌的dystrophin检测 4.1.1腓肠肌的dystrophin免疫荧光 4.1.2腓肠肌dystrophin的RT-PCR与Westernblot 4.2膈肌dystrophin的检测 4.2.1膈肌dystrophin的免疫荧光 4.2.2膈肌dystrophin的RT-PCR与Westernblot 4.3心肌dystrophin的检测 4.3.1心肌dystrophin的免疫荧光 4.3.2心肌dystrophin的RT-PCR与Westernblot 5MSCs移植后mdx鼠膈肌收缩力的改变 经检测后发现，C57鼠膈肌收缩力最大，为182.4±4.32KN/m2，与mdx鼠相比有显著性差异(P＜0.01)。治疗后12周mdx鼠与未治疗mdx鼠相比膈肌收缩力有所升高，分别为129.2±3.65KN/m2和107.7±3.45KN/m2，差异有显著性(P＜0.05)。 6mdx鼠腓肠肌、膈肌、心肌的MCP-1的表达变化 6.1MCP-1的免疫荧光检测 免疫荧光结果显示，C57鼠腓肠肌、膈肌与心肌均未见MCP-1表达，而放疗后3天与未放疗mdx鼠的上述三种组织均呈现阳性表达，表达部位位于肌细胞间隙以及结缔组织。 6.2MCP-1的Westernblot检测 C57鼠腓肠肌、膈肌与心肌只有微量的MCP-1蛋白表达，mdx鼠的腓肠肌与膈肌的该因子表达水平显著高于C57鼠与心肌(＜0.01)，其心肌表达水平与C57鼠无显著差异。放疗后mdx鼠的三种组织中该蛋白水平较未放疗mdx鼠无显著性差异。 7MSCs的CCR-2表达变化 流式细胞检查结果显示，P5代rMSCsCCR-2的表达率为51±3.6％，P6代为35±3.0％，而P7代为21±2.6％，各组间差异有统计学意义。WesternBlot结果显示P5、P6、P7代的rMSCs的CCR-2蛋白表达水平递减。 8细胞迁移实验 结论 1经CM-DiI标记的MSCs静脉移植mdx鼠后，其腓肠肌、膈肌有供体来源的dystrophin表达，并随时间延长而增加，膈肌的运动功能也得到改善；而移植后心肌内未见dystrophin表达；提示rMSCs移植体内后可能定向迁移到病变严重的组织。 2mdx鼠腓肠肌与膈肌有MCP-1的高水平表达，而心肌表达与正常C57鼠无异。 3rMSCs表达MCP-1受体CCR-2，但随体外培养时间的延长，CCR-2表达逐渐减少。 4体外实验证实mdx鼠的腓肠肌与膈肌对rMSCs的趋化作用显著高于心肌；MCP-1抗体可部分阻断MCP-1的趋化作用。 5MCP-1很可能是mdx鼠病变肌组织定向吸引外源性rMSCs的趋化因子。