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目的复制缺陷型腺病毒载体（replication deficient first generation adenovirusvector, FGAd）因其安全性好、转基因表达效率高和感染宿主细胞范围广等特点，目前正广泛应用于基因治疗。但是部分细胞特别是树突状细胞（Dendritical cells,DCs）和肿瘤细胞等低表达甚至不表达腺病毒受体（coxsackie-adnovirus receptor，CAR），限制了FGAd作为基因治疗载体的广泛应用。有研究表明，在腺病毒纤突结（fiber knob）的HI loop插入一段精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（arginine-glycine-aspartate，RGD）肽，可提高FGAd对肿瘤细胞的感染效率。然而目前已有的改造方法，多涉及对大质粒的多步酶切，连接，操作繁琐。RD细胞和T24细胞是CAR低表达的肿瘤细胞，普通的FGAd很难取得理想的感染效果，因此我们在已有方法的基础上进行改进，建立一种更简单可行的方法在FGAd纤突结的HI loop插入RGD，通过该方法构建表达增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的FGAd-RGD-EGFP，与表达绿色荧光蛋白的FGAd-EGFP在RD和T24细胞中进行体外感染和转基因表达效率的比较研究。通过该方法构建表达人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytialviruse, RSV）密码子优化型融合蛋白（codon optimized fusion glycoprotein, Fsyn）的FGAd-RGD-Fsyn，与仅表达Fsyn的FGAd-Fsyn分别免疫小鼠，进行体内免疫反应的比较研究，为改造后的载体在肿瘤等疾病治疗上的研究奠定基础。方法用EcoRⅠ酶切pAdEasy–1质粒，产生约9 kb的小片段和23 kb的大片段，之后把小片段自连，获得质粒pY，用PCR的方法在pY中插入RGD，之后再将小片段和大片段连接，获得插入RGD的pAdeasy-RGD-1质粒。pShuttle-CMV?EGFP和pShuttle-CMV?Fsyn经PmeⅠ线性化后，与pAdEasy-RGD-1在BJ5183感受态细胞中同源重组，重组成功后的pAd-RGD-EGFP和pAd-RGD-Fsyn经PacⅠ酶切回收后转染HEK293细胞，包装获得重组腺病毒FGAd-RGD-EGFP和FGAd-RGD-Fsyn。经CsCl超速离心纯化重组腺病毒,以1000病毒颗粒(viral particle number, vp)/cell的感染量,用FGAd-EGFP和FGAd-RGD-EGFP分别感染RD和T24细胞,感染后48 h,用流式细胞仪检测EGFP的表达情况。同时,分别用1×10~8 vp的FGAd-Fsyn和FGAd-RGD-Fsyn免疫小鼠,检测抗体反应情况。结果通过该方法成功构建了可表达EGFP的FGAd-RGD-EGFP和可表达Fsyn的FGAd-RGD-Fsyn。与FGAd-EGFP相比,FGAd-RGD-EGFP对RD和T24肿瘤细胞的感染效率都有显著提高,EGFP表达效率也明显增强。与FGAd-Fsyn相比,FGAd-RGD-Fsyn所引起的机体针对转基因的抗体反应并无差异。结论采用本方法改造后的腺病毒载体能显著提高对RD和T24肿瘤细胞的感染效率,但并不引起机体产生针对转基因的增强的抗体反应,该载体能用于肿瘤等疾病的基因治疗研究。该方法的建立,为腺病毒嗜性及其生物活性的改造提供了借鉴,可为肿瘤的基因治疗等提供更有效,更简易可行的载体。