在生命科学等领域的研究中,光学显微镜依其非侵入、无损伤等特点,成为科研人员最常用的研究工具之一。由于阿贝衍射极限的存在,传统光学显微镜的空间分辨率被限制在200 nm以上。然而,许多分子生物学信息,例如细胞微管等结构的特征尺度在百纳米以内,传统光学技术无法对这些生物结构进行有效观测。因此,突破光学衍射极限的限制成为相关领域科研工作者共同努力的方向。近年,受激辐射损耗(STED)成像技术凭其远场、超越衍射极限的空间分辨率、多维度活体成像且可特异性标记跟踪等优势,从各类研究方法中脱颖而出,在生物医学研究中发挥重要作用。本文中自主搭建了一套基于连续激光405 nm/532 nm的紧凑型STED成像系统,并利用该系统对不同荧光探针进行了光谱学、荧光动力学、生物组织特异性染色成像等方面的研究工作,主要内容包括:1.设计、搭建与优化紧凑型连续激光STED(CW-STED)系统。利用405 nm和532 nm连续激光器做光源,结合快速响应的声光控制模块,实现纳秒量级精确控制光束开关,抑制染料漂白现象。通过使用空间光滤波模块协同空间光精细调节模块,确保了扫描光斑的质量和双光束空间的重合。采用多波段信号收集模块,配合声光控制器、单光子计数器和压电纳米平移台,实现了高速点扫描成像。优化了激发光与损耗光聚焦光斑重合的校准方法。设计、优化光学元器件与结构,实现了STED系统的一体化、紧凑化,系统稳定性显著增强。2.基于CW-STED系统研究Coumarin 102染料荧光淬灭速率。首先,建立了基于荧光寿命、淬灭速率和振荡弛豫时间三个参数的CW-STED荧光动力学模型。随后,基于该模型,通过405 nm/532 nm CW-STED系统测量Coumarin 102染料的抑制因子,计算出荧光淬灭速率。实验结果发现,由于存在聚集态荧光淬灭现象(ACQ),荧光淬灭速率随荧光剂浓度的增大而增加。同时,损耗光功率的增大也会产生抑制光诱导淬灭现象(DIQ),显著增加荧光淬灭速率。理论分析认为DIQ现象归因于增大的损耗光功率引起了局部增强的分子间碰撞导致淬灭速率的上升。DIQ抑制了CW-STED系统的损耗效果,对提升系统空间分辨率产生不利影响。3.研究新型量子点染料STED特性。结合自主搭建的CW-STED系统,针对405nm/532nm波段,研究了三种碳量子点和两种CdSe量子点的光学特性。研究发现不同有机溶剂中,碳量子点的消光特性曲线和饱和光强值变化很大。CDs-2样品在乙醇溶剂中的饱和光强值最小,在492/10 nm荧光波段中表现出0.4 MW/cm~2的低饱和光强,是一种极具潜力的新型STED荧光探针。CdSe量子点消光效果一般,存在荧光上转换发光现象,有潜力作为新型荧光差分成像探针。4.研究生物样品的超分辨成像。介绍了多种量子点,Coumarin 102非特异性染色的小鼠脑细胞切片,Atto 390 Phalloidin免疫荧光标记神经母瘤细胞切片的STED样品制备方法。基于商用共聚焦荧光显微镜和自主搭建的CW-STED系统,研究样品共聚焦及超分辨成像,结果表明CDs-2样品实现了180 nm的共聚焦扫描分辨率。CdSe样品存在较强的自发荧光辐射和上转换发光现象,可以用于开发为荧光差分成像的新型探针。Coumarin 102染料无法特异性结合蛋白,普遍存在于细胞质,富集在不同尺寸的蛋白质结构上,存在一定生物兼容性。Atto 390 Phalloidin通过直接免疫荧光染色法与神经母瘤细胞中的F actin蛋白特异性结合,初步实现了120 nm的空间分辨率,为蓝光STED在生命科学研究领域提供更多可选方法。