论文部分内容阅读
目的:本研究的主要目的在于探究黄芪水提物(Radix Astragali extract,RAE)和其组分黄芪总黄酮(total flavonoids of Astragalus,TFA)对多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)动物模型实验性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalo-myelitis,EAE)小鼠疾病进程的影响,并探讨其可能的机制,以期为中药黄芪及其有效成分临床应用于MS治疗提供理论依据。方法:1.RAE的提取及成分含量测定:采用煎煮法提取黄芪水提物,以黄芪皂苷Ⅳ、葡萄糖、芦丁为标准品利用紫外分光光度法分别测定黄芪水提物中总皂苷、总多糖、总黄酮的含量。2.EAE模型建立、给药及病理机制相关指标检测:采用MOG35-55诱导雌性C57BL/6小鼠建立EAE动物模型。将小鼠随机分为:正常对照组、模型组(EAE)、黄芪水提物组(RAE 125、250、500 mg·kg-1)、黄芪总黄酮组(TFA 25、50、100 mg·kg-1)、阳性药组(甲泼尼龙琥珀酸钠,MPD 20 mg·kg-1)。给药组于造模前2 d灌胃给予RAE/TFA,每天1次,共23 d。给药同时采用双盲法记录神经功能评分及体重变化;苏木精伊红染色(hematoxylin eosin,HE),固蓝染色(luxol fast blue,HE)法染色检测脊髓组织炎性浸润、脱髓鞘情况;免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC)法检测脊髓组织Iba1、GFAP蛋白表达;酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测小鼠血清IL-6和TNF-α含量;流式细胞法检测脾脏CD4、CD11b、CD11c、Th1、Th17阳性细胞的比例;实时定量PCR法(q PCR)检测脊髓组织炎症相关基因m RNA表达;蛋白免疫印迹法(western blot,WB)检测脊髓组织NF-κB、PI3K/AKT、MAPK信号通路和凋亡相关蛋白表达。3.BV-2细胞炎症模型建立、给药及炎症相关指标检测:利用200 ng/ml的LPS诱导BV2细胞炎症模型,分别给予细胞TFA 100、200、300μg/ml,CAL 25、50、100μM刺激;CCK-8法检细胞活力;Greiss法检测NO释放含量;Ed U染色法检测细胞增殖;ELISA试剂盒检测培养基IL-6和TNF-α含量、q PCR法检测炎症相关基因m RNA表达;免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)法检测NF-κB入核;双荧光素酶报告基因试剂盒检测NF-κB核转录活性;WB法检测NF-κB、MAPK信号通路蛋白及炎症相关蛋白表达。结果:1、RAE对EAE小鼠作用和机制:RAE给药能有效改善EAE小鼠的发病症状,减少体重降低,延缓发病时间;RAE给药能有效减少EAE小鼠脊髓组织炎性浸润及脱髓鞘;RAE能显著降低小鼠血清IL-6含量;RAE能显著下调CD4、CD11b、CD11c阳性细胞比例;RAE低剂量(125 mg·kg-1)能有效下调脊髓NF-κB通路蛋白磷酸化及Iba1、Bax、Cleaved-caspase3等蛋白表达、显著上调PI3K/AKT通路蛋白磷酸化及Bcl2/Bax蛋白表达。2、TFA对EAE小鼠作用和机制:TFA给药能有效改善EAE小鼠的发病症状,减少体重降低,延缓发病时间;TFA给药能有效减少EAE小鼠脊髓组织炎性浸润及脱髓鞘;TFA能显著降低小鼠血清IL-6和TNF-α含量;TFA能显著下调CD11b、CD11c、Th1、Th17阳性细胞比例;TFA 50 mg/kg能显著降低脊髓组织Iba1、GFAP表达;TFA 50 mg/kg能显著下调i NOS、COX2、IL-6、TNF-ɑ、CD11b、GFAP基因m RNA的表达;TFA 50 mg/kg能显著下调脊髓NF-κB通路蛋白、i NOS、COX2、Iba1、GFAP蛋白表达。3、TFA对LPS诱导BV-2细胞作用和机制:TFA 100、200、300μg/ml能显著抑制NO的释放且对细胞活力无显著影响;TFA可剂量依赖性降低细胞培养基IL-6和TNF-α含量;TFA可剂量依赖性下调i NOS、COX2、IL-1β、TNF-ɑ、CD11b基因m RNA的表达;TFA 300μg/ml可明显抑制NF-κB入核及核转录活性;TFA可剂量依赖性下调i NOS、COX2蛋白表达及AKT、JNK、NF-κB通路蛋白磷酸化。4.CAL对LPS诱导BV-2细胞作用和机制:CAL 25、50、100μM能显著抑制NO的释放和细胞增殖;CAL可剂量依赖性降低细胞培养基IL-6和TNF-α含量;CAL可剂量依赖性下调i NOS、COX2、IL-6、TNF-ɑ、CD11b基因表达;TFA 100μM可明显抑制NF-κB入核及核转录活性;TFA可剂量依赖性下调i NOS、COX2蛋白表达及AKT、JNK、NF-κB通路蛋白磷酸化。结论:1、RAE能有效缓解EAE小鼠的发病症状,减少中枢神经系统的炎症浸润和脱髓鞘,其作用机制可能与抑制周边免疫细胞激活,削弱中枢神经系统神经炎症以及减少神经细胞的凋亡相关。2、TFA能有效缓解EAE小鼠的神经功能损伤,减少中枢炎性细胞浸润及髓鞘脱失,其作用机制可能与抑制外周免疫细胞激活,抑制中枢胶质细胞激活和抑制NF-κB信号通路激活相关。3、TFA和CAL能有效抑制LPS诱导的BV2细胞的激活,其作用机制可能与抑制NF-κB/MAPK信号通路的激活相关。