背景及目的:免疫毒素是指将抗体和毒素结合的重组蛋白,用于精准定位并杀死癌细胞,是目前癌症治疗的主要研究方向之一。免疫毒素中的抗体部分常用scds Fv片段,该片段重链与轻链之间肽链和二硫键同时存在。免疫毒素中的毒素部分有不同的来源,常用的毒素为铜绿假单胞菌分泌的一种外毒素pseudomonas exotoxin A,其改造后的片段PE38KDEL是目前应用的主要形式。重组免疫毒素在大肠杆菌中表达时非常容易形成包涵体。包涵体需要经过复杂的蛋白变复性,增加了重组蛋白生产过程中的时间成本和经济成本。促溶标签能够改善免疫毒素的可溶性表达,但含有促溶标签的重组蛋白需要切除标签,去除标签常用蛋白酶,大规模生产时使用蛋白酶降解成本很高,因此应用受到限制。内含肽是一种广泛分布在细菌、真菌和古细菌中的可以在合适条件下将两端外显肽连接在一起的功能性蛋白质,其大小一般在一百到六百个氨基酸之间,可分为经典内含肽、微小内含肽和断裂内含肽。随着人们对内含肽的深入研究,其应用越来越广泛,比如在体内和体外的蛋白半合成、阶段性同位素标记、肽链的环化等方面均有内含肽的应用。此外,内含肽在蛋白质纯化过程中可与纯化标签联用,避免了通过蛋白酶等方法去除标签对目的蛋白的影响,具有很大的应用价值和发展前景。本研究将蛋白内含肽与促溶标签和纯化标签联用,实现免疫毒素在大肠杆菌内的可溶性表达,既简化了纯化流程,减少了蛋白损失,又可通过内含肽的自我剪切作用快速去除促溶标签与纯化标签,对免疫毒素生产工艺的改进具有重大意义。研究方法:本研究中,我们采用促溶标签结合低温诱导实现免疫毒素在大肠杆菌（BL21（DE3）、SHuffle T7）胞质内可溶性表达。采用亲和层析方法实现目的蛋白纯化。采用分别表达纯化后混合的方法实现内含肽的自我断裂。采用镍柱亲和层析方法实现断裂后目的蛋白的除杂。采用超滤或Capto L柱对除杂后蛋白富集。采用FACS或Fortebio方式检测蛋白亲和力。实验通过三组促溶标签、纯化标签、内含肽与重组免疫毒素的连接应用,实现免疫毒素的可溶性表达。同时,断裂内含肽可以很容易的将标签从纯化体系除去,避免了通过蛋白酶等方法去除标签,降低实验成本。此外,本课题对影响内含肽断裂的因素进行深入研究,为开发基于大肠杆菌表达系统的可溶性表达、纯化免疫毒素类药用重组蛋白方法提供参考。研究成果:实验采用的两种内含肽为ΔICM和Npu Dna E;两种促溶标签为Trx和MBP;两种纯化标签为His和MBP;两种免疫毒素为HA22（sc ds Fv）-PE38KDEL和SS1（scds Fv）-PE38KDEL,通过内含肽、促溶标签、纯化标签和免疫毒素之间的重组实现重组免疫毒素的构建,探究在不同内含肽、不同促融标签和不同免疫毒素下重组蛋白在大肠杆菌的可溶性表达。此外,实验探究了影响断裂内含肽Npu Dna E断裂效率的因素。结果表明,不同的重组免疫毒素均可实现可溶性表达,内含肽的自我剪切可以简单快速的去除促溶标签和纯化标签,空间结构、电荷因素、所连接外显肽、时间、温度和DTT浓度对Npu Dna E断裂效率均有一定影响。实验结果为免疫毒素类重组蛋白的生产纯化工艺提供了新思路。