目的:放射治疗在头颈部肿瘤治疗中具有重要地位,而放射性颅脑损伤成为放射治疗后最常见的并发症。放射性颅脑损伤以患者认知功能障碍和情绪调节异常为主要临床特征。关于对放射性颅脑损伤发病机制的探索仍在研究当中,其中海马功能障碍,尤其是海马DG区神经发生破坏和神经增殖抑制,在放射性颅脑损伤中具有重要作用,这一观点目前已取得国内外专家的一致共识。电离辐射诱导的海马神经元凋亡可能与海马神经发生破坏和神经增殖抑制具有紧密联系,之前有研究证明电离辐射诱导的CDK5过度激活在海马神经元凋亡中扮演关键角色。在我们的研究中,我们运用了一种由24个氨基酸残基组成的P35模拟肽—P5多肽,并将其与TAT蛋白结合,使之具有穿越血脑屏障的功能。P5-TAT多肽具有抑制CDK5过度激活并保留其生理功能、抑制凋亡相关蛋白产生的作用。我们探索了在放射性颅脑损伤大鼠动物模型中P5—TAT通过抑制CDK5过度激活、减少海马DG区神经元凋亡从而改善海马功能障碍与大鼠行为学表现的神经保护作用。方法:在实验第一部分中,我们选用21天龄的雄性SD大鼠作为实验动物,并选择4MV电子线,20Gy照射剂量和特制铅版进行放射性颅脑损伤动物模型造模。随后我们用Western blot实验检测了Cdk5的上游激活蛋白p35,p39,p25,p29在照射后不同时间点的变化情况。并同时检测了CDK5及其活性相关蛋白p-GR和p-Tau的表达情况。我们也观察了凋亡标记物caspase-3的表达与变化。实验第二部分我们主要是运用Western blot实验检测P5-TAT多肽抑制CDK5过度激活与凋亡相关蛋白产生的作用。我们首先选择了3种P5-TAT多肽的治疗剂量,观察P5-TAT多肽在照射后不同时间点对Cdk5的上游激活蛋白p35,p39,p25,p29的作用情况。并同时检测了CDK5及其活性相关蛋白p-GR和p-Tau的表达情况以及对凋亡标记物caspase-3的抑制作用。另外我们也通过观察最大剂量P5-TAT多肽(400ug/kg)治疗后大鼠体重与脑重的变化,初步评价其毒性。在第三部分中,我们用免疫荧光染色检测了P5-TAT多肽治疗后,海马DG区神经发生破坏和神经增殖抑制的改善情况。我们主要检测了P5-TAT多肽治疗后不同时间点的DG区前体细胞增殖情况以及神经前体细胞向成熟神经元分化、成熟神经元的存活等情况。从而验证了海马DG区神经元凋亡减少对海马功能障碍的改善。第四部分,我们利用Morris水迷宫、新物体识别、开放场等行为学实验验证了20Gy照射剂量成功诱导了放射性颅脑损伤与认知功能障碍,并证实P5-TAT多肽治疗通过改善海马DG区神经发生和神经增殖、成熟神经元存活减轻了放射性颅脑损伤与认知功能障碍。本研究结果均来自至少三次的独立重复实验,用平均数±标准方差表示,利用GraphPad Prism 5.0统计学软件进行数据分析和作图。结果:1.SD大鼠全脑照射后,CDK5上游激活蛋白p35,p39,p25,p29表达明显改变,CDK5异常激活,凋亡蛋白caspase-3也明显表达。P5-TAT多肽抑制了电离辐射诱导的CDK5过度激活与凋亡相关蛋白产生。我们首先用Western blot实验检测海马照射1小时、3小时、6小时、12小时、24小时、3天、7天后CDK5上游激活蛋白p35,p39,p25,p29的表达,发现和对照组相比,p25、p29在照射后1小时开始升高,在照射后6小时到达顶点,p35、p39在照射后1小时开始降低,在照射后6小时到达最低点。接着我们检测了CDK5下游的活性相关蛋白p-GR和p-Tau,发现p-GR和p-Tau在照射后6小时表达明显升高,证明CDK5异常激活。随后我们也在照射后6小时检测到了凋亡蛋白caspase-3也明显表达。我们首先选择了3种P5-TAT药物浓度,包括100ug/kg,200ug/kg,400ug/kg。我们主要是运用Western blot实验检测P5多肽抑制CDK5过度激活的作用,发现照射前预先给SD大鼠注射P5—TAT,在照射后6小时p-GR和p-Tau的表达均被明显抑制,证明P5—TAT抑制了电离辐射诱导的CDK5过度激活。其中P5—TAT药物浓度为400ug/kg时对CDK5活性最为明显。所以我们选用400ug/kg作为实验药物浓度。随后我们发现P5—TAT对Cdk5的上游激活蛋白p35,p39,p25,p29并无影响。这证明P5—TAT对CDK5的生理功能并无影响。最后我们发现P5—TAT在照射后6小时明显抑制了凋亡标记物caspase-3的表达,证明了P5—TAT可能抑制了海马神经元的凋亡。另外我们也通过观察P5-TAT多肽治疗1月和2月后大鼠体重与脑重的变化,发现相比于照射组,P5—TAT治疗组并未有死亡率、体重与脑重的明显差别,我们对其毒性做出初步评价,认为其未带来明显副作用。2.P5-TAT多肽改善了放射性海马DG区神经增殖抑制和神经发生破坏,促进了成熟神经元的存活。我们运用免疫荧光染色检测照射组与P5-TAT治疗组DG区的神经增殖与神经发生、成熟神经元存活情况。我们首先运用BrdU标记海马DG区增殖细胞,发现相比于照射组,P5-TAT治疗3天后BrdU阳性细胞数明显增多,证明P5-TAT可能改善了放射性海马DG区神经增殖抑制。随后我们采用NeuN标记照射一月后海马DG区成熟神经细胞,展现海马DG区成熟神经元的生长情况。我们发现相比于照射组,P5-TAT治疗一月后NeuN+细胞数明显增多,证明P5-TAT可能改善了放射性海马DG区成熟神经元减少。最后我们采用BrdU和NeuN先后标记照射两月后海马DG区神经细胞,展现海马DG区神经发生过程。我们发现相比于照射组,P5-TAT治疗两月后BrdU+/NeuN+细胞数明显增多,证明P5-TAT可能改善了放射性海马DG区神经发生破坏。3.P5-TAT治疗缓解了放射性认知功能障碍。我们发现在旷场实验中,相比于照射组,P5-TAT治疗提高了照射后SD大鼠在中央区域运动的时间和网格总数目。在新物体识别实验中,P5-TAT治疗提高了照射后SD大鼠识别新物体的能力。在Morris水迷宫实验中,全脑照射后的SD大鼠在照射后第四天和第五天展现了更多的到达平台延迟时间,而P5-TAT治疗改善了SD大鼠定向航行行为学表现。在第六天的空间探索实验中,P5-TAT治疗增加了照射后SD大鼠穿越平台的次数以及在目标象限的时间比例。这证明P5-TAT治疗改善了大鼠的空间记忆能力。结论:1.SD大鼠全脑照射后,CDK5上游激活蛋白p35,p39,p25,p29表达明显改变,CDK5异常激活,凋亡蛋白caspase-3也明显表达。这证明20Gy全脑照射引起了明显的海马细胞凋亡。而P5-TAT多肽抑制了电离辐射诱导的CDK5过度激活与凋亡相关蛋白产生。我们发现照射前预先给SD大鼠注射P5—TAT,在照射后6小时电离辐射诱导的CDK5过度激活被抑制。而P5—TAT对Cdk5的上游激活蛋白p35,p39,p25,p29并无影响。这证明P5—TAT对CDK5的生理功能并无影响。最后我们发现P5—TAT在照射后6小时明显抑制了凋亡标记物caspase-3的表达,证明了P5—TAT可能抑制了海马神经元的凋亡。另外我们也通过观察P5多肽治疗1月和2月后大鼠体重与脑重的变化对其毒性做出初步评价,认为其未带来明显副作用。2.P5-TAT改善了放射性海马DG区神经增殖抑制和神经发生破坏,促进了成熟神经元的存活。我们发现相比于照射组,P5-TAT治疗3天后BrdU阳性细胞数明显增多,P5-TAT可能改善了放射性海马神经增殖抑制。随后我们发现相比于照射组,P5-TAT治疗一月后NeuN+细胞数明显增多,证明P5-TAT可能改善了放射性海马成熟神经元减少。最后我们发现相比于照射组,P5-TAT治疗两月后BrdU+/NeuN+细胞数明显增多,证明P5-TAT可能改善了放射性海马DG区神经发生破坏。3.P5-TAT治疗缓解了放射性认知功能障碍。我们发现在旷场实验中,相比于照射组,P5-TAT治疗提高了照射后SD大鼠在中央区域运动的时间和网格总数目。在新物体识别实验中,P5-TAT治疗提高了照射后SD大鼠识别新物体的能力。在Morris水迷宫实验中,全脑照射后的SD大鼠在照射后第四天和第五天展现了更多的到达平台延迟时间,而P5-TAT治疗改善了SD大鼠行为学表现。在第六天的空间回忆实验中,P5-TAT治疗增加了照射后SD大鼠穿越平台的次数以及在目标象限的时间比例。这证明P5-TAT治疗改善了大鼠的长期记忆能力。