异戊二烯(Isoprene)是一种具有挥发性和疏水性的萜类烃分子,是萜类化合物的组成骨架,在橡胶、香水和农药制造等领域有着广泛的工业应用。目前主要以石油作为原料获得异戊二烯,但随着石油资源的日益枯竭及其使用所带来的污染使得异戊二烯的生产受到限制,亟需一种绿色无污染且可持续的异戊二烯合成方法。而近年来随着生物合成技术的不断崛起,通过微生物合成异戊二烯成为了当前研究的热点。其中酿酒酵母作为真核类模式菌株,不仅具有清楚的遗传背景、高糖代谢分解速率和较强的适应工业工艺条件能力等优点,而且具有天然类异戊二烯合成途径通量高的优点,因而是生产异戊二烯类产品的良好宿主。本研究以酿酒酵母作为底盘细胞,通过增加细胞质中乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)通量、筛选甲羟戊酸(MVA)途径关键酶等来挖掘增加异戊二烯合成产量的新途径。具体结果如下:(1)通过敲除乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)通往线粒体支流的基因来增加细胞质中乙酰辅酶A的通量。敲除线粒体丙酮酸载体基因(MPC2)、线粒体孔蛋白基因(POR2)和丙酮酸脱氢酶复合体的Elα亚基基因(PDA1)来切断Acetyl-CoA通往线粒体的支流来挖掘提高酿酒酵母异戊二烯产量的代谢途径。将含有银白杨的异戊二烯合酶基因ispS的表达载体转入以上3个敲除体中,进行摇瓶发酵,结果表明:敲除PDA1基因的效果最好,异戊二烯的产量达到35 μg.L-1。相比较原始菌株,产量提高了 0.3倍。然后在敲除PDA1基因的基础上分别进一步敲除基因MPC2和POR2,发酵结果表明:异戊二烯的产量没有得到进一步提高。(2)以单敲除PDA1基因的菌株作为基础,在细胞质中过表达来自Leuconostoc m esenteroide的木酮糖5-磷酸特异性磷酸转酮酶(LmPK)和Clostridium kluyveri的磷酸转乙酰酶基因(CkPTA)来进一步增加细胞质中Acetyl-CoA的通量。发酵结果表明:异戊二烯的产量并没有得到进一步提高。(3)在上述基础上对MVA途径的关键酶基因进行筛选及增强表达以提高下游代谢通量。本研究分别筛选了来源于大肠杆菌、酿酒酵母和番茄的IDI1(IPP isomerase,I DI1)基因,通过摇瓶发酵,结果表明:来源于大肠杆菌的IDI1基因效果最好,异戊二烯的产量达到了 54μg·L-1,提高了约1倍。另外,分别引入来源于酿酒酵母及Ruegeri a pomeroyi的HMGR基因,通过摇瓶发酵,结果表明:酵母本身的HMGR基因效果更好,异戊二烯的产量达到了 103 μg·L-1,相较于原始菌株,提高了 2倍。本研究结合基因工程、代谢工程和合成生物学,探索了酿酒酵母细胞质中的乙酰辅酶A通量增加的新途径,然后对MVA途径中关键酶进行了研究及调控,挖掘了提高酿酒酵母异戊二烯产量的关键酶基因,为异戊二烯的进一步研究提供了一定的参考。