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目的:肌肉减少症最早由Irwin Rosenberg提出,定义为一种与年龄相关的骨骼肌质量和功能下降的疾病,在老年甚至在中年人群中均可发生。2019年,欧洲老年人肌肉减少症工作组(EWGSOP)制定了新的肌肉减少症的诊断标准,其中与年龄相关的骨骼肌强度和质量下降被定义为原发性肌肉减少症,而由疾病、营养及药物相关等因素引起的骨骼肌强度和质量下降则被定义为继发性肌肉减少症。继发性肌肉减少症可导致患者原有疾病加重、易发生跌倒、使骨折风险增加,严重者丧失生活自理能力等,增加死亡风险,给患者及社会带来沉重的精神和经济负担,这使得肌肉减少症近年来越来越受到学者的关注。随着人们生活方式及饮食习惯的改变,2型糖尿病(T2DM)的患病人数呈井喷式增长,由其引起的继发性肌肉减少症逐渐步入人们的视野,成为T2DM的一种新的并发症。由于肌肉减少症的研究起步时间较晚,糖尿病与继发性肌肉减少症的相关研究较少,发病机制尚不明确,可能与高血糖、胰岛素抵抗、炎症与氧化应激、线粒体功能障碍、外周神经病变、代谢紊乱等等有关,其中氧化应激引起了我们的注意:近期研究证明了氧化应激、铁死亡与继发性肌肉减少症密切联系,研究发现枸橼酸铁干预的小鼠肌肉组织和细胞中出现铁死亡,经过去铁胺治疗后铁死亡标志物明显降低,在肌卫星细胞中,转铁蛋白的缺失将引起肌卫星细胞铁死亡,影响肌肉功能等,因此,我们推测铁死亡可能在糖尿病肌肉减少症发生发展中扮演重要角色,并且可能成为一个潜在的治疗靶点。为了探究潜在的治疗靶点,我们选择了RNA结合蛋白ELAVL1,它在铁死亡过程中扮演的重要作用,ELAVL1能结合Beclin-1m RNA并激活NCOA4调控的铁自噬,使更多的铁蛋白在溶酶体中被降解,铁离子被释放而产生大量活性氧,最终引起铁死亡。此外,在T2DM骨质疏松中,本课题组的前期研究证实了ELAVL1的过表达可以导致成骨细胞内氧化应激的增多,破坏细胞内结构,引起骨质疏松,而敲除ELAVL1可以通过抑制氧化应激和铁死亡改善成骨细胞功能,然而,ELAVL1在肌肉系统的作用尚不明确。恒古骨伤愈合剂(osteoking)是传统中药,在临床上被应用于治疗骨关节炎与骨质疏松,其主要成分为三七、黄芪、人参、红花、杜仲、陈皮等,含有抑制氧化应激作用特殊成分,因此,我们推测该药对继发性肌肉减少症可能具有一定的治疗作用。然而,恒古骨伤愈合剂的在肌肉方面的治疗作用尚待研究。本研究旨在揭示T2DM与继发性肌肉减少症目前的研究热点与研究前沿,探究恒古骨伤愈合剂对糖尿病肌肉减少症的治疗作用以及其作用机制,旨在为糖尿病肌肉减少症的预防和治疗提供新的思路。研究方法:(1)本研究通过文献计量学分析的手段,了解T2DM与肌肉减少症的研究现状与热点,以指导后续研究。(2)通过高脂饮食与链脲佐菌素(STZ)注射进行糖尿病肌肉减少症小鼠模型的构建,将C57BL6小鼠分为对照组(NC),糖尿病组(DM)以及恒古骨伤愈合剂治疗组(OS),通过肌肉力量(小鼠握力与抓网实验)、肌肉质量(体重与腓肠肌湿重、瘦肉质量、micro-CT)以及组织学分析(H&E染色、masson染色、Myo D与FBXO32的免疫组化)对肌肉减少症进行评价之后,构建C2C12成肌细胞系,将其分为对照组(NC)、高糖组(HG)、高糖+恒古骨伤愈合剂组(HG+OS),通过CCK8检测细胞活性、Western blot检测细胞Myo D与FBXO32,从动物与细胞两方面评估恒古骨伤愈合剂对糖尿病肌肉减少症的治疗作用。(3)通过网络药理学分析预测了恒古骨伤愈合剂对肌肉减少症的治疗机制,并进行细胞实验验证:将C2C12细胞分为对照组(NC)、高糖组(HG)、高糖+恒古骨伤愈合剂组(HG+OS)、高糖+去铁胺组(HG+DFO),通过MDA,ROS,GSH、C11 BODIPY581/591检测其氧化应激与脂质过氧化水平。(4)通过透射电镜验证了糖尿病小鼠肌肉组织与细胞出现铁死亡现象,为验证相关机制,应用Western blot检测各组成肌细胞内ELAVL1、Beclin-1、FTH-1、NCOA4、GPX4、LC3的表达情况之后,使用ELAVL1过表达慢病毒转染细胞,将C2C12细胞分为对照组(NC)、高糖组(HG)、高糖+恒古骨伤愈合剂组(HG+OS)、ELAVL1过表达组(LV-ELAVL1)与空转组(LV-null),通过Western blot检测与免疫荧光共定位验证恒古骨伤愈合剂抑制铁死亡的机制猜想。结果:(1)文献计量学分析结果表明糖尿病肌肉减少症的相关研究起步较晚,且日韩与美国在糖尿病与肌肉减少症的研究中占主导地位,目前该领域的研究主要局限于临床,基础研究较为缺乏。(2)糖尿病C57小鼠抓力下降、悬网时间缩短、腓肠肌湿重降低、肌体积减少、肌纤维横截面积减少而纤维化面积增多,经过恒古骨伤愈合剂治疗后抓力较糖尿病小鼠提高、悬网时间延长、腓肠肌湿重和肌肉体积增加、肌肉组织学结构改善。高糖条件下C2C12细胞活性下降、肌萎缩相关蛋白FBXO32表达增高、肌分化蛋白MYOD表达降低,恒古骨伤愈合剂干预后,C2C12细胞活性改善、肌萎缩相关蛋白FBXO32表达减少、肌分化蛋白MYOD表达升高。(3)网络药理学分析结果表明恒古骨伤愈合剂可能通过抑制氧化应激与炎症反应,调控脂质代谢治疗肌肉减少症,细胞实验证实高糖条件下C2C12细胞ROS,MDA表达升高、GSH表达降低、C11 BODIPY 581/591显示处于氧化态的细胞较多,而恒古骨伤愈合剂和去铁胺干预后氧化态细胞均明显减少,表明恒古骨伤愈合剂可能通过抑制氧化应激与脂质过氧化治疗糖尿病肌肉减少症,这与网络药理学预测结果一致。(4)透射电镜观测显示糖尿病小鼠肌纤维排列紊乱、线粒体肿胀、高糖条件下C2C12细胞线粒体双层膜皱缩,嵴皱缩或消失,出现铁死亡现象,免疫组化显示糖尿病小鼠肌肉组织ELAVL1表达增高,血清ELISA结果显示糖尿病小鼠血清铁蛋白和肌肉组织中铁蛋白含量均升高,而恒古骨伤愈合剂干预后降低;高糖组细胞ELAVL1、FTH-1、Beclin-1、NCOA4与LC3表达升高,而恒古骨伤愈合剂和去铁胺干预组表达降低;高糖组细胞GPX4表达降低,恒古骨伤愈合剂和去铁胺干预组表达升高;慢病毒转染后,免疫荧光结果显示高糖组与ELAVL1过表达组LC3与NCOA4共定位增强,铁自噬表达增高,空转病毒组与恒古骨伤愈合剂治疗组LC3与NCOA4共定位减少。结论:(1)糖尿病肌肉减少症的研究局限于临床,基础研究较为缺乏。(2)恒古骨伤愈伤合剂可治疗糖尿病C57小鼠肌肉减少症,改善高糖条件下C2C12细胞功能。(3)恒古骨伤愈合剂可抑制高糖条件下C2C12细胞氧化应激。(4)恒古骨伤愈合剂可抑制ELAVL1诱导的C2C12细胞铁死亡。