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精原干细胞(SSC)是雄性动物体内唯一能向子代传递遗传信息的成体干细胞,其增殖与分化的每个环节都可能影响生物个体的生殖能力或育性,潜在的生物学意义使其成为科学研究的热点。大量研究证实,胶质细胞源神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor,Gdnf)与其受体复合物Gfrα1(Gdnf family receptor alpha 1)/Ret信号通路是介导哺乳类SSC自我更新及维持的关键因素,但其在鱼类SSC中的作用如何,目前知之甚少。本实验室研究发现,青鳉(Oryzias latipes)存在两种不同基因编码的Gdnf直系同源物,即Gdnfa与b,两者在硬骨鱼类SSC自我更新与维持中均具有重要作用,但其具体作用机制如何,尚不清楚。我们前期分析发现,Gfrα1广泛存在于硬骨鱼类,并且存在复制基因,即gfrα1a与b,但其在硬骨鱼类的表达模式如何,在SSC中的作用如何,两者是否具有类似功能,均有待于进一步研究。青鳉体型小、繁殖快,并有从其成体精巢建立的精原干细胞系SG3。该细胞系体外培养已达140代,依然能稳定增殖并保持分化潜能,从而为鱼类SSC增殖与分化相关研究提供了极好研究工具与平台。本研究以青鳉为研究对象,对其gfrα1a与b的cDNA序列、表达模式及其在SSC中的作用进行了研究,具体结果如下:1.cDNA与序列分析成功获得青鳉两种不同基因编码的gfrα1 cDNA序列,分别命名为Olgfrα1a与Olgfrα1b,分别编码524、466个氨基酸;两者均具有Gdnf受体家族成员的特征性结构,即富含半胱氨酸的结构域D1-3,同时两者均含有哺乳类GDNF结合的特征性基序MLF/RRR;两者的氨基酸一致度为52%,与其他物种Gfrα1一致度也高达50%以上;系统进化、基因共线性分析结果均表明,Olgfrα1a与Olgfrα1b为鱼类复制基因,两者均为哺乳类Gfrα1的同源物。2.mRNA表达模式Olgfrα1a与b在桑葚胚、囊胚、原肠胚、刚孵化小鱼、SG3、脑、眼睛、心脏、肠、肝、脾脏、卵巢、精巢中均有表达,其中在SG3、精巢中高表达。原位杂交检测Olgfrα1a与b在青鳉性腺中的细胞表达水平及类型。结果显示,在成体精巢(3月龄)中,Olgfrα1a高表达于精原细胞,并主要见于细胞质中,在初级精母细胞和次级精母细胞中表达量降低,精细胞和精子中未见其表达;Olgfrα1b在精巢中的细胞表达水平及类型与Olgfrα1a类似,但在细胞质与细胞核中均可见到大量阳性信号。在卵巢中,Olgfrα1a与b表达于不同时相的卵母细胞中。3.在SSC中的作用(1)Vivo-Morpholino敲降的特异性构建含有Olgfrα1a与b敲降靶点的报告基因载体,分别命名为pCV1a-DsRed与pCV1b-DsRed;用完全培养基ESM2培养SG3,分为3组,每组3孔细胞,每组分别转染pCV1a-DsRed、pCV1b-DsRed及对照质粒pCV-DsRed,然后加入Gfrα1a、Gfrα1b的Vivo-Morpholino(后面均简称为Gfrα1aMo与Gfrα1bMo)及ConMo(与Gfrα1a的靶点序列有5个碱基错配),48 h后荧光显微镜观察。结果显示,Gfrα1aMo能抑制pCV1a-DsRed红色荧光蛋白的表达,其有效性达90%以上,而其对pCV1b-DsRed与pCV-DsRed无明显抑制作用,表明Gfrα1aMo能特异性敲降SG3 Gfrα1a的表达;与Gfrα1aMo类似,Gfrα1bMo能特异性敲降Gfrα1b的表达,其有效性达90%以上,而ConMo无明显抑制作用。(2)对细胞增殖活性的影响用含青鳉Gdnfa或b的基础培养基5N培养SG3,Vivo-Morpholino敲降SG3的Gfrα1a或(与)b的表达,通过EdU掺入法检测细胞增殖活性。结果显示,在5N培养基中,敲降Gfrα1a或b对SG3的增殖活性无显著性影响(p>0.05);在含Gdnfa的5N培养基中,Gfrα1a或b的敲降均会显著抑制SG3的增殖活性(p<0.05),Gfrα1a与b同时敲降细胞增殖活性最低;在含Gdnfb的5N培养基中,Gfrα1a的敲降可显著抑制SG3的增殖活性(p<0.05),而Gfrα1b的敲降无明显影响(p>0.05),两者共敲细胞的增殖活性与单敲Gfrα1a无显著差异(p>0.05)。上述研究结果表明,Gfrα1a与b均对SG3细胞的增殖具有重要作用;Gfrα1a可通过与Gdnfa或b结合发挥作用,而Gfrα1b只通过与Gdnfa结合发挥作用。(3)对细胞存活的影响用含青鳉Gdnfa与b的5N培养SG3,Vivo-Morpholino敲降SG3的Gfrα1a或(与)b的表达,48 h后用AnnexinV-FITC/PI检测细胞存活情况。结果显示,Gfrα1a与b共同敲降可导致细胞凋亡率(FITC)显著升高,从对照的26.4%升高到64.5%,而单敲Gfrα1a或b细胞凋亡率与对照无显著差异(p>0.05),从而表明,Gfrα1a与b对于细胞的存活均具有重要作用,并且两者功能可以相互补偿。(4)对细胞增殖与分化相关基因表达的影响用ESM2培养SG3,同时敲降Gfrα1a与b的表达,7 d后定量PCR检测细胞增殖与分化相关基因的表达。结果显示,与对照组相比,敲降组细胞增殖相关基因如klf4、lin28b、bcl6b、etv5的mRNA表达显著下降(p<0.05),而分化基因c-kit表达上调(p<0.05)。提示,Gfrα1a与b可能通过上调增殖相关基因、抑制分化基因的表达介导SG3的自我更新与维持。(5)对精巢组织精原细胞增殖活性的影响取2-3月龄青鳉精巢组织,ESM2体外培养,每条鱼的精巢组织平分为两组,一组加入Gfrα1aMo与Gfrα1bMo各2.5μM,另一组加入ConMo 5μM作为对照,3 d后加入EdU,以检测Gfrα1a与b敲降对细胞增殖活性的影响。结果显示,对照组细胞增殖活性阳性(EdU~+)显著多于敲降组(p<0.05)。从而表明,Gfrα1a与b敲降可抑制精巢组织中精原细胞的增殖。该研究首次在硬骨鱼类证实Gfrα1a与b在SSC自我更新与维持中均具有重要作用,两者功能类似。该研究不仅为SSC增殖与分化研究提供了重要参考,而且将促进SSC在转基因动物生产、珍稀优质鱼类种质资源保护等领域的应用。