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水稻（Oryza sativa L.）作为最重要的粮食作物之一，其花粉育性一直是研究的重点。本实验室此前的研究发现，对Osj10gBTF3编码序列的抑制会导致植株显著微型化和花粉典型败育。为深入研究其导致花粉败育的分子机制，本研究主要以该蛋白及与其互作的两个蛋白OsPPR676和OsHSP82为研究对象，开展了以下几个方面的工作：1）OsPPR676特性及表型分析；2）OsPPR676参与调控花粉发育的分子机制；3）OsHSP82的特征及其表型；4）Osj10gBTF3和OsHSP82共同伴侣OsPPR676向叶绿体转运的机制分析。主要结果与结论如下：
1.双分子荧光互补技术（BiFC）进一步验证了OsPPR676与Osj10gBTF3之间的互作关系。亚细胞定位显示OsPPR676是一个质体定位的PPR-SMR蛋白。利用CRISPR基因编辑技术创建的osppr676突变体与其RNA抑制株系均表现出植株的显著微型化和花粉的典型败育，表明质体蛋白OsPPR676是植株生长与花粉发育必需的蛋白。
2.OsPPR676在玉米中的同源蛋白ATP4是叶绿体atpB翻译必需的蛋白。利用western blot检测发现OsPPR676具有相似的功能，且OsPPR676的缺失导致ATP合成酶的活性降低。进一步对花药的总可溶性脂质的组分分析显示突变体的花药中可溶性脂肪酸的含量下降了约50%，且几乎所有的脂肪酸组分都大幅减少。此外，花粉I2-KI染色显示突变体中20%-45%的花粉无淀粉或含有很少量的淀粉。表明OsPPR676可以通过影响叶绿体ATP合成酶的β亚基atpB的翻译，调控依赖ATP的脂肪酸和淀粉合成过程，进而参与水稻的花粉发育。
3.OsHSP82与OsPPR676互作，且激酶OsSnRK1.1通过介导OsPPR676蛋白的磷酸化促进OsHSP82/Osj10gBTF3与OsPPR676的互作。hsp82突变体表现出明显的植株微型化和部分花粉败育，表明OsHSP82是植株生长和花粉发育必需的蛋白。
4.OsHSP82蛋白定位于细胞质及膜系统，但不在叶绿体内部。Osj10gBTF3除在细胞核及细胞质定位外也在叶绿体内部的分布。Osj10gBTF3和OsHSP82均具有叶绿体相关动态性。对OsPPR676在野生型、btf3-1与hsp82-1水稻原生质体中的定位及定量检测显示在两个突变体中，OsPPR676均表现明显的内质网或细胞质滞留信号，表明Osj10gBTF3和OsHSP82的敲除阻碍了OsPPR676向叶绿体的转运。进一步检测发现，两个突变体中，叶绿体atpB显著减少，且ATP合成酶活性显著降低，这很有可能是由于叶绿体中OsPPR676积累较少导致。
5.Osj10gBTF3或OsHSP82与OsPPR676互作信号分布的观察显示OsHSP82与OsPPR676的互作信号停留在叶绿体表面，而Osj10gBTF3与OsPPR676的互作信号在叶绿体表面及内部均有分布，但内部信号稍弱。OsHSP82蛋白与14-3-3和Toc64互作；而Osj10gBTF3蛋白除与Toc64互作外，还与Cpn60互作。进一步检测发现Osj10gBTF3与Tic110相互作用，表明Osj10gBTF3通过与Tic110的互作穿过内叶绿体内膜到达叶绿体基质。微量热泳动技术检测发现Osj10gBTF3和OsPPR676之间的结合最弱，最终由于自身缺乏竞争力，逐渐从OsPPR676解离导致信号减弱。Osj10gBTF3与OsHSP82间的互作及互作信号的分布表明Osj10gBTF3，OsHSP82和OsPPR676在细胞质以复合体的形式参与OsPPR676的转运。进一步分析发现这三个蛋白形成复合体的目的是防止OsPPR676在向叶绿体转运过程中的降解。
综上所述，本研究揭示了水稻质体PPR-SMR蛋白OsPPR676通过调控ATP合成酶的β亚基翻译在花粉发育中发挥重要功能的分子机制；阐明了Osj10gBTF3和OsHSP82以不同方式介导OsPPR676向叶绿体的转运机制。
1.双分子荧光互补技术（BiFC）进一步验证了OsPPR676与Osj10gBTF3之间的互作关系。亚细胞定位显示OsPPR676是一个质体定位的PPR-SMR蛋白。利用CRISPR基因编辑技术创建的osppr676突变体与其RNA抑制株系均表现出植株的显著微型化和花粉的典型败育，表明质体蛋白OsPPR676是植株生长与花粉发育必需的蛋白。
2.OsPPR676在玉米中的同源蛋白ATP4是叶绿体atpB翻译必需的蛋白。利用western blot检测发现OsPPR676具有相似的功能，且OsPPR676的缺失导致ATP合成酶的活性降低。进一步对花药的总可溶性脂质的组分分析显示突变体的花药中可溶性脂肪酸的含量下降了约50%，且几乎所有的脂肪酸组分都大幅减少。此外，花粉I2-KI染色显示突变体中20%-45%的花粉无淀粉或含有很少量的淀粉。表明OsPPR676可以通过影响叶绿体ATP合成酶的β亚基atpB的翻译，调控依赖ATP的脂肪酸和淀粉合成过程，进而参与水稻的花粉发育。
3.OsHSP82与OsPPR676互作，且激酶OsSnRK1.1通过介导OsPPR676蛋白的磷酸化促进OsHSP82/Osj10gBTF3与OsPPR676的互作。hsp82突变体表现出明显的植株微型化和部分花粉败育，表明OsHSP82是植株生长和花粉发育必需的蛋白。
4.OsHSP82蛋白定位于细胞质及膜系统，但不在叶绿体内部。Osj10gBTF3除在细胞核及细胞质定位外也在叶绿体内部的分布。Osj10gBTF3和OsHSP82均具有叶绿体相关动态性。对OsPPR676在野生型、btf3-1与hsp82-1水稻原生质体中的定位及定量检测显示在两个突变体中，OsPPR676均表现明显的内质网或细胞质滞留信号，表明Osj10gBTF3和OsHSP82的敲除阻碍了OsPPR676向叶绿体的转运。进一步检测发现，两个突变体中，叶绿体atpB显著减少，且ATP合成酶活性显著降低，这很有可能是由于叶绿体中OsPPR676积累较少导致。
5.Osj10gBTF3或OsHSP82与OsPPR676互作信号分布的观察显示OsHSP82与OsPPR676的互作信号停留在叶绿体表面，而Osj10gBTF3与OsPPR676的互作信号在叶绿体表面及内部均有分布，但内部信号稍弱。OsHSP82蛋白与14-3-3和Toc64互作；而Osj10gBTF3蛋白除与Toc64互作外，还与Cpn60互作。进一步检测发现Osj10gBTF3与Tic110相互作用，表明Osj10gBTF3通过与Tic110的互作穿过内叶绿体内膜到达叶绿体基质。微量热泳动技术检测发现Osj10gBTF3和OsPPR676之间的结合最弱，最终由于自身缺乏竞争力，逐渐从OsPPR676解离导致信号减弱。Osj10gBTF3与OsHSP82间的互作及互作信号的分布表明Osj10gBTF3，OsHSP82和OsPPR676在细胞质以复合体的形式参与OsPPR676的转运。进一步分析发现这三个蛋白形成复合体的目的是防止OsPPR676在向叶绿体转运过程中的降解。
综上所述，本研究揭示了水稻质体PPR-SMR蛋白OsPPR676通过调控ATP合成酶的β亚基翻译在花粉发育中发挥重要功能的分子机制；阐明了Osj10gBTF3和OsHSP82以不同方式介导OsPPR676向叶绿体的转运机制。