【摘 要】
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绿僵菌（Metarhizium anisopliae）是一种重要的昆虫病原真菌,在侵染害虫的过程中会分泌蛋白酶类降解害虫体壁、分泌真菌毒素等次级代谢产物杀死害虫。绿僵菌诱变株的毒力显著提高、并且其蛋白酶的表达与真菌毒素的分泌等发生了明显的变化。为了弄清绿僵菌毒力变化与菌体中蛋白酶的表达变化、真菌毒素代谢变化等方面的关系,本论文利用双向电泳检测了诱变菌株菌丝蛋白,发现其与亲本菌株的菌丝蛋白存在较大的
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绿僵菌（Metarhizium anisopliae）是一种重要的昆虫病原真菌,在侵染害虫的过程中会分泌蛋白酶类降解害虫体壁、分泌真菌毒素等次级代谢产物杀死害虫。绿僵菌诱变株的毒力显著提高、并且其蛋白酶的表达与真菌毒素的分泌等发生了明显的变化。为了弄清绿僵菌毒力变化与菌体中蛋白酶的表达变化、真菌毒素代谢变化等方面的关系,本论文利用双向电泳检测了诱变菌株菌丝蛋白,发现其与亲本菌株的菌丝蛋白存在较大的差异,提取菌丝蛋白后利用TMT（Tandem Mass Tag）技术对其测序并分析蛋白表达方面的差异,对其中蛋白表达显著上调的nrb6基因进行PCR扩增并获得了全长基因序列,测序、分析了其序列变化。具体研究包括以下几个方面:（1）高毒力绿僵菌诱变株的筛选及其差异蛋白表达的培养条件优化。以小菜蛾和褐飞虱为生物测定对象,筛选出高毒力的绿僵菌紫外诱变株（诱变株Ma-UVIII）,筛选出的诱变株Ma-UVIII对高渗溶液、细胞壁破坏剂和抗氧化能力等抗逆性增强。对比菌株发酵液及菌丝中次级代谢产物的HPLC图谱,发现绿僵菌野生菌株（菌株Ma-WT）和诱变株Ma-UVIII的出峰曲线明显不同;与菌株Ma-WT的出峰曲线相比,诱变菌株Ma-UVIII在前15 min内的出峰数明显减少,但在20至25 min内的出峰数则明显增多。经SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）检测分析发现,在相同培养条件下诱变株Ma-UVIII发酵液和菌丝中总蛋白含量显著高于菌株Ma-WT发酵液和菌丝中总蛋白含量,诱变株Ma-UVIII发酵液中出现了许多新的蛋白条带,菌株Ma-WT与诱变株Ma-UVIII菌株菌丝中的蛋白条带也不相同。优化了诱变株Ma-UVIII菌丝中差异蛋白表达的培养条件为不含蛋白胨的查氏培养液、25℃、培养5d。（2）绿僵菌诱变株总蛋白的测序与分析。通过TMT定量蛋白质组学技术对绿僵菌诱变株Ma-UVIII的菌丝总蛋白进行了测序与分析,在绿僵菌蛋白数据库中共鉴定到总蛋白质4638个。按照表达倍数变化1.2倍以上（即上调大于1.2倍或者下调小于0.83倍）且P<0.05的标准筛选表达差异的蛋白,与绿僵菌Ma-WT相比较,诱变株Ma-UVIII上调表达的差异蛋白693个,下调表达的差异蛋白质766个,总共1459个表达差异的蛋白;经过GO（Gene Ontology）功能和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析发现,这些表达差异的蛋白主要具有催化活性、绑定、结构分子活性、运输、抗氧化等方面的功能,主要参与代谢过程、细胞生命活动、生物调节以及生物过程调节等重要生物学过程。（3）nrb6基因的克隆与序列分析。从诱变株Ma-UVIII的表达差异蛋白中选取NRB6蛋白为研究对象,分别从菌株Ma-WT和诱变株Ma-UVIII基因组DNA中扩增nrb6基因的ORF片段,经测序和比对分析发现诱变株Ma-UVIII的nrb6基因ORF序列中有32碱基发生了改变、有5个氨基酸发生了改变,ORF序列前面的启动子序列中有6个碱基发生了改变。经蛋白质功能查询与分析,绿僵菌NRB6蛋白属于Polyprenyl synthetase（IPR000092）家簇,其蛋白序列中的第31-323个氨基酸与Isopreniod synthase domain superfamily（IPR008949）的氨基酸相似,Polyprenyl synthetase的保守位点在89-103aa、208-220aa处。
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