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亚磷酸脱氢酶(EC 1201.1),将底物亚磷酸盐氧化为磷酸盐,同时将催化反应所必须的氧化型烟酰胺辅酶(NAD+)还原为还原型烟酰胺辅酶(NADH).该酶能够代谢利用低价态亚磷酸盐,同时产物伴随有还原型烟酰胺辅酶的生成,这两大特点使得亚磷酸脱氢酶在转基因生物技术研究领域和工业生物催化的辅酶再生领域都有着巨大的应用潜能和广阔的发展空间。本研究以罗尔斯通菌属(Ralstonia so.strain 4506)中的亚磷酸脱氢酶基因为基础,通过人工密码优化合成,在大肠杆菌中克隆表达。亚磷酸脱氢酶基因(prxD)全长1011bp,共编码336个氨基酸,预测蛋白分子量大小为36.7kDa。酶学性质分析表明最适温度为45℃,最适pH为7.0。在40"C和45℃下处理100min,仍保持催化活性,但在50℃处理20min活性几乎完全丧失。在pH4.5-9.5范围内活性相对稳定,均保持在80%以上。该酶对亚磷酸盐的Km和kcat值分别为9.35±0.37mM和157.48±1.99 min-1,催化效率(kcat/Km)为16.85 mM-1·min-1;对NAD+的Km和kcat值分别为0.53±0.02mM和190.24±2.09 min-1,催化效率(kcat/Km)为353.02 mM-1·min-1。为提高亚磷酸脱氢酶的催化活性,通过定向进化技术在约10000个突变株中筛选得到一株催化活性有所提高的突变株PTDH-M20,该突变株与野生型氨基酸序列相比,第139位的酪氨酸被色氨酸替代,最适温度和pH均与野生型保持一致,突变株PTDH-M20对亚磷酸盐的Km和kcat值分别为6.52-_+0.34mM和459.1±6.29 min-1,催化效率(kcat/Km)为70.46mM.min-1;对NAD+的Km和kcat值分别为0.97±0.04mM和501.23±7.97mmin-1,对NAD+催化效率分别为(kcaat/Km)为514.71mM-1·min-1。突变株对亚磷酸盐的亲和力比野生型提高30%,催化效率比野生型提高近3倍,对NAD+的亲和力下降了83%,但催化效率仍然提升了45.8%。为进一步研究139位点对于该酶催化活性的影响和作用,引入其他18种氨基酸进行定点饱和突变研究。只有当该位点突变为苯丙氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、蛋氨酸和精氨酸时突变株才具有催化活性,突变为其它13种氨基酸后突变体均失活。在上述5株突变体中,PTDH-Y139F和PTDH-Y139Q的活性变化最为明显,对亚磷酸盐PTDH-Y139F和PTDH-Y139Q的催化效率分别是野生型的5.19倍和5.83倍。对NAD+而言,PTDH-Y139F和PTDH-Y139Q的催化效率分别是野生型的2.74倍和2.89倍。该结果为该酶的结构功能研究提供重要信息,也为该酶在工业和转基因研究领域的应用奠定了基础。以Fe304磁性纳米颗粒作为载体结合交联聚集体(CLEAs)的固定化方法对亚磷酸脱氢酶进行固定化研究。固定化酶Fe3O4-PTDH的最适温度为50℃,比游离态PTDH提高5℃,最适pH为6.5。在50℃下处理100min后仍然保留约50%的催化活性,55℃和60℃下处理100min后保留约25%的催化活性,热稳定比游离态PTDH有了显著的改善。将固定化酶Fe3O4-PTDH循环回收利用10次后,保留有57%的催化活性,表现出较优良的循环利用性。该酶的固定化研究为降低生产成本了奠定基础。