背景食管癌是世界范围内同时也是我国最常见的恶性上皮性肿瘤之一,严重危害人类健康。目前针对食管癌的治疗如手术切除、放射治疗、化学治疗及其它综合治疗虽然有一定的治疗效果,但患者的5年生存率仍然低下,肿瘤侵袭转移仍是导致患者死亡的主要原因。因此,从分子水平探讨食管癌侵袭转移机制,找到针对食管癌侵袭转移的有效治疗靶点,对于延长食管癌患者的生存期及提高生活质量有重要意义。去整合素域和金属蛋白酶域蛋白(A Disintegrin And Metalloprotease domain,ADAMs)家族是新近发现的一类和基质金属蛋白酶共享“金属蛋白酶区域”的基因家族,属于跨膜糖蛋白,到目前为止,已发现超过40余种。该家族成员与细胞外基质降解、基底膜的破坏、细胞迁移、细胞融合、信号传导等方面紧密相连,因此,在肿瘤的发生发展及侵袭转移中具有重要作用。ADAM10是该家族的重要成员之一,定位于15q22,编码由748个氨基酸组成的蛋白。ADAM10蛋白活化后锚定在细胞膜的表面,通过水解各种底物,包括粘附分子(cell adhesion molecules,CAMs)和细胞外基质(extracellular matrix,ECM),参与肿瘤的发生发展和侵袭转移。截至目前,有关ADAM10在食管鳞癌发生发展、侵袭转移中的作用及机制研究在国内外尚未见报道。目的为阐明ADAM10在食管鳞癌发生发展、侵袭转移中的作用及其与细胞粘附分子E-cadherin的关系,本研究首先检测食管鳞癌组织中ADAM10、E-cadherin的表达,分析它们与食管鳞癌发生发展及侵袭转移的关系。其次通过调控食管鳞癌细胞株ADAM10的表达,观察其对细胞增殖力、侵袭迁移能力的影响以及对E-cadherin表达的调控。最后观察食管癌裸鼠移植瘤中ADAM10对肿瘤的生长的影响及E-cadherin表达的调控。第一部分ADAM10在食管鳞状细胞癌中的表达及其意义方法1.采用免疫组织化学方法检测122例人食管鳞癌组织及60例正常食管粘膜组织中ADAM10和E-cadherin蛋白的表达情况。2.采用原位杂交方法检测122例人食管鳞癌组织及60例正常食管粘膜组织中ADAM10和E-cadherin m RNA的表达情况。3.统计学处理:所有数据用SPSS17.0统计软件进行分析。计数资料采用χ~2检验,检验水准α=0.05。结果1.122例人食管鳞状细胞癌组织中,ADAM10 m RNA和蛋白的表达明显高于正常食管粘膜组织,差异具有统计学意义(P<0.01);ADAM10 m RNA和蛋白在食管鳞癌组织中的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期呈正相关(P<0.05),而与性别、年龄及组织学分级无关(P>0.05)。2.122例人食管鳞状细胞癌组织中,E-cadherin mRNA和蛋白的表达明显低于正常食管粘膜组织,差异具有统计学意义(P<0.01);E-cadherin m RNA和蛋白在食管鳞癌组织中的表达与肿瘤组织学分级、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期呈负相关(P<0.05),而与性别、年龄无关(P>0.05)。3.122例人食管鳞状细胞癌组织中,ADAM10蛋白和E-cadherin蛋白的表达呈负相关(P<0.01)。第二部分ADAM10的表达调控对食管鳞癌细胞侵袭迁移能力的影响及机制研究方法1.Real-time PCR及western blot方法检测三种食管鳞癌细胞Eca109、EC-1及TE-1 ADAM10 m RNA及蛋白表达情况,同时以原代培养正常食管鳞状上皮细胞(normal esophageal epithelial cells,NEECs)作为对照。2.侵袭小室和划痕实验检测三种食管鳞癌细胞Eca109、EC-1及TE-1体外侵袭和迁移能力,并观察细胞侵袭迁移能力和ADAM10基因表达的关系。3.设计合成针对ADAM10的小干扰RNA,同时设计合成无义链作为阴性对照,用脂质体Lipofectamine 2000包裹转染高侵袭食管鳞癌EC-1细胞。Real-time PCR及western blot检测ADAM10 si RNA对ADAM10表达的抑制效果以及对E-cadherin表达的影响。4.侵袭小室、划痕实验及CCK-8实验检测ADAM10 si RNA转染对EC-1细胞体外侵袭迁移能力及增殖能力的影响。5.统计学处理:所有数据用SPSS 17.0统计软件进行分析。计数资料比较采用χ~2检验;计量资料采用x±s表示,比较采用t检验;检验水准α=0.05。结果1.ADAM10 m RNA及蛋白在三种食管鳞癌细胞Eca109、EC-1及TE-1中的表达均明显高于正常食管鳞状上皮细胞(NEECs)(P<0.01),在食管鳞癌EC-1细胞中的ADAM10 m RNA及蛋白表达量最高,在TE-1细胞中表达最低,差异有统计学意义(P<0.05)。2.三种食管鳞癌细胞Eca109、EC-1及TE-1中,EC-1的穿膜细胞数最多,划痕愈合能力最强,与Eca109和TE-1相比,差异有统计学意义(P<0.05);而TE-1的穿膜细胞数最少,划痕愈合能力最弱,与Eca109和EC-1相比,差异有统计学意义(P<0.05)。3.EC-1细胞转染ADAM10 si RNA 48 h后,与对照si RNA组及空白细胞组相比,ADAM10 m RNA及蛋白表达明显下调,且差异有统计学意义(P<0.01)。4.EC-1细胞转染ADAM10 si RNA 48 h后,与对照si RNA组及空白细胞组相比,E-cadherin m RNA及蛋白表达明显上调,且差异有统计学意义(P<0.01)。5.EC-1细胞转染ADAM10 si RNA 48 h后,ADAM10 si RNA转染组细胞穿膜细胞数及划痕愈合能力均明显减弱,增殖能力下降,与对照si RNA组及空白细胞组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。第三部分ADAM10对食管鳞癌裸鼠移植瘤生长及E-cadherin表达的影响方法1.将食管鳞癌EC-1细胞注射到裸鼠腋下构建食管鳞癌裸鼠移植瘤动物模型。2.将成功构建的食管鳞癌裸鼠移植瘤动物模型随机分成3组:ADAM10si RNA组、阴性对照si RNA组及空白细胞组。每组5只裸鼠。实验组注射ADAM10si RNA,对照si RNA组注射无义si RNA,空白细胞组注射PBS。均采用瘤旁注射的方法进行治疗,隔日1次,共15次。3.实验结束后,取瘤称重并计算肿瘤体积,HE染色观察移植瘤形态学特点,real time PCR及免疫组化检测移植瘤组织ADAM10及E-cadherin的m RNA和蛋白表达。4.统计学处理:所有数据用SPSS 17.0统计软件进行分析。计数资料比较采用χ~2检验;计量资料采用x±s表示,两组均数的比较采用t检验,多组均数的比较采用方差分析(ANVOA),检验水准α=0.05。结果1.与对照si RNA组和PBS处理组相比,ADAM10 si RNA处理组裸鼠移植瘤生长受抑,肿瘤体积和重量明显减小,差异有统计学意义(P<0.01);而对照si RNA组和PBS处理组肿瘤体积和重量无明显差异(P>0.05)。2.ADAM10 si RNA处理组裸鼠移植瘤形态学变化明显,主要表现为核固缩并碎裂,并可见点、片状坏死。3.与对照siRNA组和PBS处理组相比,ADAM10 si RNA处理组裸鼠移植瘤ADAM10 m RNA及蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.01)。对照si RNA组和PBS处理组裸鼠移植瘤中ADAM10 m RNA及蛋白的表达无明显差异(P>0.05)。4.与对照si RNA组和PBS处理组相比,ADAM10 si RNA处理组裸鼠移植瘤E-cadherin m RNA及蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.01)。对照si RNA组和PBS处理组裸鼠移植瘤中E-cadherin m RNA及蛋白的表达无明显差异(P>0.05)。结论1.ADAM10基因在食管鳞癌组织和细胞中过度表达,且与食管鳞癌的侵袭转移呈正相关。提示ADAM10在食管鳞癌发生发展及侵袭转移中发挥重要作用。2.在体外食管鳞癌细胞中利用RNA干扰技术,能有效沉默ADAM10基因表达,并调控E-cadherin的表达,降低细胞体外侵袭、迁移力及抑制细胞增殖。提示ADAM10通过调控E-cadherin参与食管鳞癌细胞的侵袭转移。3.食管鳞癌裸鼠移植瘤动物模型体内研究显示,ADAM10 si RNA能有效降低移植瘤中ADAM10基因的表达,并调控E-cadherin表达,抑制移植瘤生长。提示ADAM10是食管鳞癌分子靶向治疗的有效靶点。