【摘 要】
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研究背景及目的胰腺癌作为恶性程度最高的肿瘤之一,总体5年生存率仅9%。胰腺癌难治的根源是其高侵袭性的生物学行为、早期诊断困难以及辅助治疗手段的缺乏。研究胰腺癌的发生发展机制和寻找相关治疗靶点一直是胰腺癌的研究热点。Cripto-1又称畸胎瘤衍生生长因子1,是表皮生长因子EGF-Cripto-1/FRL1/Cryptic（EGF-CFC）基因家族成员之一,Cripto-1蛋白在胚胎早期发育尤其是干细
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研究背景及目的胰腺癌作为恶性程度最高的肿瘤之一,总体5年生存率仅9%。胰腺癌难治的根源是其高侵袭性的生物学行为、早期诊断困难以及辅助治疗手段的缺乏。研究胰腺癌的发生发展机制和寻找相关治疗靶点一直是胰腺癌的研究热点。Cripto-1又称畸胎瘤衍生生长因子1,是表皮生长因子EGF-Cripto-1/FRL1/Cryptic（EGF-CFC）基因家族成员之一,Cripto-1蛋白在胚胎早期发育尤其是干细胞的再生、分化过程中起重要作用。研究表明在多种恶性肿瘤,如乳腺癌、结直肠癌、胃癌等中Cripto-1高表达,而在相应正常组织中Cripto-1不表达或低表达,而且Cripto-1可能在肿瘤的早期诊断、靶向治疗、预后评估等多方面有重要价值。在胰腺癌中,尚未有关于Cripto-1的表达情况及其临床意义的报道。本研究旨在探讨Cripto-1表达水平与胰腺癌患者预后及胰腺癌细胞恶性生物学行为之间的关系,并初步探索其潜在分子机制。研究方法1.以免疫组织化学染色的方法检测正常胰腺组织、胰腺癌及相应癌旁组织、慢性胰腺炎等相关组织中Cripto-1蛋白的表达水平,探讨胰腺癌组织中Cripto-1表达水平与临床病理参数之间的关系及预后价值。2.用CRISPR-Cas9方法构建Cripto-1稳定敲除的MIA PaCa-2细胞系。在Cripto-1敲除组及其对照组MIAPaCa-2细胞中,使用CCK8法检测敲除Cripto-1对胰腺癌细胞增殖能力及对吉西他滨化疗敏感性的影响,PI单染及流式细胞术检测细胞周期变化,Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡变化,流式细胞术检测肿瘤干细胞表型的变化,Transwell迁移侵袭实验检测Cripto-1对胰腺癌细胞迁移侵袭能力的影响。Western blotting方法检测Cripto-1敲除后上皮间质转化标志物表达情况,检测凋亡标志蛋白、肿瘤细胞耐药相关蛋白和Nodal/Activin以及Akt/MAKP通路通路相关蛋白的表达情况。初步探讨Cripto-1影响胰腺癌细胞生物学行为和化疗耐药的分子机制。3.应用Cripto-1稳定敲除的MIA PaCa-2细胞株构建裸鼠皮下移植瘤模型,检测Cripto-1表达水平对皮下移植瘤生长速度的影响。研究结果1.Cripto-1在慢性胰腺炎、胰腺癌组织中的表达水平显著高于正常胰腺组织;Cripto-1在低分化胰腺癌组织中高表达;Cripto-1高表达的胰腺癌患者生存期短于Cripto-1低表达的患者（8个月vs16个月,P=0.029）。2.敲除Cripto-1后,MIAPaCa-2细胞的增殖能力受到抑制（P<0.05）;S期及M期细胞的比例减少（P<0.001）,同时G0/G1期细胞比例增加（P<0.001）;cleaved caspase 3和cleaved PARP表达水平上升,总凋亡率上升;磷酸化Akt、磷酸化p44/42MAPK、磷酸化Smad-2和Nodal表达水平下降。Cripto-1敲除组MIA PaCa-2细胞迁移侵袭能力均明显低于对照组（P<0.05）,E-cadherin表达水平升高,N-cadherin、Vimentin、MMP-2和β-catenin等表达水平下降。敲除Cripto-1的MIAPaCa-2细胞对吉西他滨的敏感性增加,干细胞相关表型CD133、CD44、CXCR4和EpCAM等表达水平下降,耐药相关蛋白HIF-1α,MDR-1和干细胞相关标志蛋白Nanog,Otc4的表达水平下降3.裸鼠的皮下移植瘤模型中,Cripto-1敲除组的移植瘤体积增长显著低于对照组（P<0.001）,且几乎不生长。研究结论Cripto-1在胰腺癌及慢性胰腺炎中的表达水平显著高于在胰腺正常组织中的表达水平,提示Cripto-1可能在胰腺癌的早期发生和发展过程中起重要作用。同时Cripto-1在低分化胰腺癌组织中高表达,Cripto-1高表达提示不良预后,有一定预后价值。Cripto-1可以经Nodal/Activin和Akt/MAPK通路,促进细胞周期向G0/G1期转化,抑制凋亡,从而促进细胞增殖;能经Wnt/β-catenin通路促进EMT过程,促进胰腺癌细胞的迁移侵袭。Cripto-1通过上调细胞耐药相关蛋白,增加胰腺癌细胞干细胞的比例等机制,降低胰腺癌细胞对吉西他滨化疗的敏感性。
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