【摘 要】
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研究背景:Claudin-7是细胞间紧密连接的主要组成部分,研究显示其在肝癌、乳腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤中表达异常,并促进了这些恶性肿瘤的发生及发展,然而claudin-7在结直肠癌中的作用尚不明确。目的:明确结直肠癌组织及正常组织中claudin-7的表达情况,评估claudin-7在结直肠癌中的预后意义及其对结直肠癌细胞增殖、迁移和转移的影响,并对其在结直肠癌中的作用机制进行探讨。方法:1、分
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研究背景:Claudin-7是细胞间紧密连接的主要组成部分,研究显示其在肝癌、乳腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤中表达异常,并促进了这些恶性肿瘤的发生及发展,然而claudin-7在结直肠癌中的作用尚不明确。目的:明确结直肠癌组织及正常组织中claudin-7的表达情况,评估claudin-7在结直肠癌中的预后意义及其对结直肠癌细胞增殖、迁移和转移的影响,并对其在结直肠癌中的作用机制进行探讨。方法:1、分析结直肠癌组织及正常组织中claudin-7的mRNA表达情况:首先通过GEO、TCGA数据库分析结直肠癌组织及正常组织中的claudin-7 mRNA表达情况,然后通过real time PCR检测38对新鲜结直肠癌组织及正常组织中claudin-7 mRNA的表达情况。2、通过对231例Ⅱ期结直肠癌组织及72例正常组织进行免疫组化染色,评估claudin-7在结直肠癌组织及正常组织中的蛋白表达情况。3、采用平板克隆形成实验及MTT实验检测claudin-7敲除对结直肠癌细胞增殖的影响。4、采用细胞划痕实验及Transwell实验检测claudin-7敲除对结直肠癌细胞迁移的影响。5、体内实验观察claudin-7的敲除对nod-SCID小鼠皮下成瘤及肝转移的影响。6、预后分析:首先通过GEO数据库分析claudin-7在公共数据库中的预后价值,其次,对我院231例行根治性手术切除的Ⅱ期结直肠癌患者进行单因素及多因素预后分析,从而评估claudin-7在Ⅱ期结直肠癌中的预后意义。7、应用RNAseq分析、Pearson相关性分析以及Western Blot初步探讨claudin-7的作用机制。结果:1、GEO、TCGA数据库以及real time PCR的分析结果显示,结直肠癌组织中claudin-7 mRNA的表达水平明显低于正常组织（P<0.0001）。2、免疫组化染色结果显示,与正常组织相比,结直肠癌组织中claudin-7的蛋白表达水平明显降低（P<0.001）。3、平板克隆形成实验显示claudin-7敲除后可以有效促进结直肠癌细胞的克隆形成（P<0.05）;MTT实验证实,与对照组细胞相比,claudin-7敲除后的细胞增殖能力显著增强（P<0.05）。4、细胞划痕实验和transwell实验结果显示claudin-7敲除后的细胞迁移能力显著强于对照细胞（P<0.01;P<0.001）。5、体内实验结果显示:接种claudin-7敲除的SW480细胞的小鼠皮下肿瘤体积及重量明显大于对照组（P<0.05）;接种claudin-7敲除的SW480细胞的小鼠发生肝转移的数量明显高于对照组（P<0.01）。6、Claudin-7低表达患者的预后明显差于claudin-7高表达患者,多因素分析显示神经侵犯（P=0.026）及claudin-7表达水平（P=0.028）是影响Ⅱ期结直肠癌患者无病生存的独立预测因素。基于claudin-7及神经侵犯这两个独立预后影响因素进一步将患者划分为A（claudin-7高表达+神经侵犯阴性）,B（claudin-7高表达+神经侵犯阳性或claudin-7低表达+神经侵犯阴性）,C（claudin-7低表达+神经侵犯阳性）三组,统计分析显示三组间的无病生存具有统计学差异（P<0.001,log-rank test）。7、RNAseq分析结果显示,同空载体对照细胞相比,ZEB1在claudin-7敲除的SW480细胞中显著上调,Pearson相关性分析结果显示claudin-7与ZEB1之间存在显著的负相关（r=-0.526,P<0.0001）,Western blot实验进一步证实敲除claudin-7可以上调ZEB1的表达。结论:Claudin-7在癌组织中的表达水平明显低于正常组织,claudin-7的低表达促进了结直肠癌的增殖、迁移和转移。此外,claudin-7的表达也可作为Ⅱ期结直肠癌无病生存的预测指标,claudin-7联合神经侵犯能够更好的将Ⅱ期结直肠癌患者的无病生存进行分层。
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