水稻黑条矮缩病与植物激素的相关性及抗病品种的培育

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水稻是世界上重要的粮食作物之一,全世界有超过半数的人以食用水稻为主,水稻黑条矮缩病(rice black-streaked dwarf disease,RBSDD)是由水稻黑条矮缩病毒(rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)引起的水稻病害,该病可导致病株生长迟缓、矮化、抽穗结实困难,严重影响了水稻的生产。为了降低RBSDD对我国粮食生产的危害,提高水稻产量及品质,本研究对RBSDD的感病及发病机制进行了较全面的解析。以正常及感染黑条矮缩病的水稻为材料,通过对不同材料进行显微观察,几丁质酶活性测定,结合ELISA法测定内源激素含量,初步探讨水稻的感病及抗病机制。结果显示,感病水稻材料的细胞长度较正常水稻细胞短,韧皮部细胞排列略显不规则,推测病毒可能通过引起维管系统发育迟缓,导致病株矮化;感病水稻中几丁质酶活性显著提高,是正常植株的2.7倍;植物激素中ABA,IAA含量升高,而GA含量下降,推测病程相关蛋白几丁质酶及植物激素可能通过对植物免疫系统的调节而在植物抗病过程中发挥作用,并进一步影响植物的育性及生长发育,其作用机制有待进一步探讨。同时,为深入解析水稻黑条矮缩病的感病及发病机制、及材料感病后体内响应及代谢调控途径,故应用高通量测序技术,对正常及感病水稻植株的基因进行了数字基因表达谱研究(Digital Gene Expression Profiling,DGE),测序结果结合GO功能富集分析、表达模式聚类、Pathway显著性富集分析等,筛选并获得了192个差异表达基因,有11个基因编码细胞色素P450s,28个基因和防御和应激相关,12个基因和光合作用相关,次生代谢产物合成途径富集差异表达基因数量最多。并进一步对差异表达基因的表达模式进行了qRT-PCR验证,其中10个基因中,有7个变化趋势与DGE结果一致,4个符合的较好,初步证明通过高通量测序获得的数据真实、可信。RNA干扰(RNA interference,RNAi)介导的植物抗病毒研究是近年来引起广泛关注的植物抗病毒基因工程策略。通过RNA干扰抑制病毒基因表达具有实用性、高效性。鉴于RBSDV全基因组序列已经全部测定,各基因片段编码的蛋白功能也有一定研究。本研究在此基础上,根据水稻黑条矮缩病病毒S1,S6,S7-1,S7-2,S8,S9,S10等共七条RNA双链序列信息,设计了七对病毒特异性引物,并获得了相应的干扰片段,将这些干扰片段分别构建RNA干扰载体,并进一步构建入以玉米泛素Ubi为启动子、以生物安全性的bar基因为选择标记的植物双元表达载体pCAMBIA1300中,经农杆菌介导对黄淮稻区主栽水稻品种“圣稻13”进行遗传转化,并获得转基因苗。为水稻的种质创新及抗病水稻新品种的培育提供理论指导及候选材料。综上所述,本研究利用基因工程手段解决水稻黑条矮缩病的水稻病害问题,以期能培育并获得抗水稻黑条矮缩病能力提高的转基因水稻新品种。以正常及感染黑条矮缩病的水稻为材料,通过高通量测序结合数字表达谱对感病材料中基因表达情况进行了研究,并对感病材料各组织进行了显微观察及生理和生化指标的测定,对引起感病植株病害症状的生理生化变化及相关机制进行了探讨。该方面的工作及相关差异表达基因的获得,是在分子基础上对水稻黑条矮缩病感病及可能发病机制的首次报道,为进一步解析水稻对黑条矮缩病的感病及发病机制奠定了基础。同时利用RNA干扰技术结合基因工程的方法,进行了抗黑条矮缩病水稻的培育,希望获得具有较高抗性水平、能够稳定遗传的抗黑条矮缩病水稻新种质,提高水稻的产量和品质。
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