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苹果(Malus domestica B.)是世界上最重要的鲜食和加工果品之一。目前,我国已成为世界上最大的鲜食苹果和苹果浓缩汁生产国,但加工原料多是含酸量较低的鲜食苹果,浓缩汁产品酸度不高,使其在国际市场上价格竞争力较低。生产上迫切需要发展酸度高的加工品种。为了研究苹果酸度的调控机制,本文克隆了苹果酸代谢和储藏过程中4个关键酶基因的全长或部分cDNA,并对其进行了表达分析。主要结果如下:1.从苹果果实中克隆了细胞质NADP–ME基因M–ME(GenBank注册号:DQ280492)、液泡膜H+–ATPase A亚基基因MVA–A(GenBank注册号:EF128033)和液泡膜H+–PPase基因M–PPi(GenBank注册号:DQ989335)的全长cDNA序列,以及PEPC基因的部分cDNA序列。1)M-ME编码区全长2048 bp,编码一个含有590个氨基酸残基的蛋白质,估计分子量大小为64.98 kD,预测等电点(pI)为5.9。M–ME与其它植物NADP–ME的同源性在90%以上,含有5个与NADP结合有关的高度保守区。2)MVA-A编码区全长1872 bp,编码一条623个氨基酸残基的多肽链,分子量约68.9 kD。MVA–A与拟南芥、番茄、胡萝卜、棉花、绿豆等草本植物的同源性均高于90%;与梨、桃、蜜橘等果树的同源性达到95%以上,其中和梨的同源性高达99.20%,仅有6个氨基酸残基存在差异;其氨基酸序列中存在一段富含甘氨酸的保守序列GAFGCGKT(252-259 aa)。3)M-PPi编码区全长2280 bp,编码一条759个氨基酸残基的多肽链,分子量约79.4 kD。M–PPi与拟南芥、水稻、大麦、玉米、绿豆、桃、梨、葡萄等陆生植物的同源性都在80%以上,含有DVGADLVGKVE(246-256 aa)、TEYYTS(415-420 aa)和GDTIGD(715-720 aa)三个保守序列。亲水性分析发现存在14个跨膜区。4)PEPC的cDNA片断长3084 bp,含有3’-Poly(A)尾巴,同预计cDNA全长相差110 bp左右,推导氨基酸序列同其它物种有较高同源性。2. PEPC在高酸基因型果实中的转录水平随着果实发育趋于下降,在低酸基因型果实中其转录水平趋于增加。两种基因型之间相比较,花后30~90天该基因在高酸果实中的转录显著高于低酸果实,而花后90~150天两种基因型之间的差异不明显。3. M–ME在高酸基因型果实中转录水平随着果实发育趋于降低;在低酸基因型果实中,其转录呈双峰曲线,分别在花后60和120天出现两个转录高峰。花后60~150天M-ME在高酸基因型果实中的转录水平一直低于低酸果实。4. MVA–A在高酸基因型果实中转录水平逐渐降低;而低酸基因型果实中该基因的转录水平趋于增加。花后30~60天,高酸基因型果实中MVA–A的转录水平显著高于低酸果实;但在花后90~150天,高酸基因型果实中该基因的转录水平则低于低酸果实。5. M–PPi在高酸基因型果实中转录水平随着果实发育趋于降低;在低酸基因型果实中,其转录水平一直维持在一个较低水平。就两种基因型而言,M-PPi在高酸基因型果实中的转录水平一直高于低酸果实。6.重组载体pET30a-ME转化表达菌株BL21后,用IPTG诱导表达一条约66 kD的融合蛋白,诱导8 h后其表达量最大。