盲和视力受损是世界范围内严重的公共卫生、社会和经济问题。在我国,由角膜病引发的角膜混浊是致盲的重要原因,仅次于白内障。此前,本实验室通过乙烷基亚硝基脲(ENU)诱导小鼠突变的方法获得一例在C57BL/6(B6)背景下,突变杂合子表现为角膜混浊表型小鼠,突变基因鉴定发现该角膜病是由Mycn基因编码区第1217位碱基(bp)处发生单个碱基转换(T转换为C),导致MYCN蛋白第406位氨基酸由V(缬氨酸)转变为A(丙氨酸)引起,故将该突变小鼠命名为Mycn V406A,另外遗传实验发现该小鼠突变纯合子致死。故本文以MycnV406A突变杂合子(Mycn V406A/+)小鼠为研究对象,从以下三个部分开展研究:1、Mycn V406A角膜混浊小鼠遗传实验及角膜组织学分析将Mycn V406A/+小鼠与野生型B6小鼠配种,观察后代小鼠表型并进行基因型鉴定。结果发现在66只后代小鼠中有31只MyctnV406A/+基因型小鼠,其中20只表现为角膜混浊,4只具有明显小眼表型,7只正常表型。在20只确定为角膜混浊的小鼠中,9只小鼠初生时(P0)出现眼睑开放表型。故将Mycn V406A/+角膜混浊小鼠分为出生后眼睑开放型和闭合型两种类型。对6-8周(W)小鼠眼球H.E染色发现:(1)相比于野生型小鼠,眼睑开放型小鼠角膜上皮局部增厚,角膜基质层常见新生血管及少量炎性细胞;(2)眼睑闭合型小鼠角膜上皮略微变薄,角膜基质层偶见新生血管。2、Mycn V406A突变对小鼠角膜上皮细胞分化的影响分析筛选出6-8 W出生后眼睑开放型与闭合型角膜混浊小鼠,设同窝野生型小鼠对照。采用免疫组织化学技术对小鼠角膜上皮细胞keratin 12(Krt12)、keratin 14(Krt14)、keratin 10(Krt10)的表达情况进行检测。结果发现:(1)野生型小鼠角膜上皮所有细胞Krt12组化结果呈阳性、Krt10呈阴性,基底层少许细胞Krt14呈弱阳性;(2)眼睑开放型小鼠角膜上皮细胞局部Krt12组化结果为阴性、除表层少许细胞外Krt14表达水平异常升高、局部异常表达Krt10;(3)眼睑闭合型小鼠角膜上皮细胞Krt12及Krt10组化结果未见明显异常,而Krt14表达与眼睑开放型相似。正常小鼠于胚胎期16.5天(E16.5)眼睑发生闭合,为了确定出生后眼睑闭合型角膜混浊小鼠表型及角膜上皮细胞分化异常是否由胚胎期小鼠眼睑闭合延迟直接引起,继续对E16.5眼睑开放比例进行统计并对MycnV406A/+E16.5小鼠眼区进行H.E和免疫组织化学分析。结果发现:(1)遗传统计发现E16.5眼睑开放小鼠比例类似于角膜混浊小鼠比例,且高于初生时眼睑开放小鼠比例,提示部分小鼠眼睑闭合延迟并于出生前闭合;(2)与野生型小鼠相比,MycnV406+E16.5眼睑开放眼区角膜上皮异常增厚,Krt12表达异常且Krt14表达水平明显升高,而MycnV406A/+E16.5眼睑闭合眼区无异常,推测胚胎期眼睑闭合延迟可能影响角膜上皮细胞分化。3、Mycn V406A突变影响角膜上皮细胞分化的机制的初步分析筛选出6-8 W出生后眼睑开放型与闭合型角膜混浊小鼠,设同窝野生型小鼠对照。采用免疫组织化学技术对小鼠角膜上皮细胞周期蛋白D1(cyc1in D1)、整合素β 1(Integrin β1)、整合素β4(Integrin β4)、E-钙粘素(E-cadherin)进行检测。结果发现:(1)野生型小鼠角膜上皮整合素β1、β4阳性细胞主要局限于基底层且整合素β1呈弱阳性;眼睑开放型小鼠角膜上皮细胞整合素β1、β4均呈强阳性且角膜上皮增厚区呈阴性;眼睑闭合型小鼠角膜上皮所有细胞整合素β1、β4呈强阳性。(2)与野生型小鼠相比,眼睑开放型和闭合型小鼠角膜上皮细胞周期蛋白D1阳性细胞减少。(3)除开放型小鼠角膜表层细胞组化结果为阴性外,三组小鼠角膜上皮E-钙粘素免疫组织化学均呈阳性且无明显差异。研究显示:在前期获得一例角膜混浊小鼠并确定其由Mycn基因突变引起,在此基础上进一步发现角膜混浊可分为出生后眼睑开放型和闭合型两种并对突变小鼠进行遗传实验、角膜上皮组织学分析,从而了解MycnV406A突变引起小鼠角膜病变特点;免疫组织化学结果发现突变小鼠角膜上皮细胞分化异常,该异常可能与整合素β1、整合素β4、细胞周期蛋白D1表达异常有关。