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Mycn是Myc原癌基因家族的一员,主要参与细胞增殖、代谢、分化和肿瘤发生等多种细胞过程。国内外对于Mycn基因的研究主要围绕肿瘤的发生,少数对眼的研究显示Mycn基因能够影响视网膜及晶状体的发育,但目前为止尚无Mycn基因与角膜混浊相关性的报道。本实验室之前的研究通过乙烷基亚硝基脲(ENU)诱导了一例C57BL/6(B6)背景的Mycn突变小鼠,该突变鼠杂合子呈角膜混浊表型。故本研究从美国杰克逊实验室引入Mycn基因敲除小鼠进行进一步验证,并对角膜混浊小鼠组织学特点及角膜混浊形成机制进行研究。1 Mycn基因与小鼠角膜混浊相关性验证从美国杰克逊实验室引入MycntmlPsk/J(Mycnflox/+)小鼠以及广泛表达Cre酶的EIIa-Cre工具鼠,基于Cre-loxP系统原理,两种小鼠配种后获得Mycn基因敲除(MycnKO/+)小鼠,该小鼠出生后表现为角膜混浊(外显率约为68.4%),另外研究还发现部分角膜混浊小鼠在初生时呈眼睑开放表型,故将角膜混浊小鼠分为初生时眼睑闭合型及开放型两种类型。2 Mycn基因敲除小鼠角膜组织学特点分析对2周龄(2W)、6周龄(6W)及8周龄(8W)眼睑闭合型小鼠、眼睑开放型小鼠及同窝对照小鼠角膜HE染色结果表明:(1)与正常小鼠相比,眼睑闭合型小鼠在2W时角膜上皮增厚,8W时角膜上皮变薄;(2)眼睑开放型小鼠角膜上皮从2W开始显著增厚并出现角化层且逐渐严重。另外角膜混浊小鼠基质层可见新生血管及炎性细胞。对2W、6W及8W小鼠角膜中CD31进行免疫组织化学染色后发现:正常小鼠基质层CD31表达为阴性,表明无新生血管;从2W开始眼睑闭合型小鼠基质层CD31组化呈弱阳性,进一步证明角膜基质出现新生血管;从2W开始眼睑开放型小鼠基质层有大量CD31强阳性信号,进一步证明角膜基质出现新生血管。对2W、6W及8W小鼠角膜中角膜上皮细胞分化标志物角蛋白12(K12),上皮细胞分化标志物角蛋白14(K14)和特异性表皮分化标志物角蛋白10(K10)进行免疫组织化学染色后发现:(1)正常小鼠角膜上皮仅表达K12,不表达K10,K14表达在2W时仅局限于上皮细胞基底部,后表达逐渐降低;(2)与正常小鼠相比,眼睑闭合型小鼠角膜上皮在2W和6W时K12表达无明显变化,8W时在角膜变薄区域K12表达量有所降低,K14表达在2W、6W及8W时均表达增强,K10为阴性;(3)在2W、6W及8W时,眼睑开放型小鼠角膜增厚区K12表达均呈阴性而非增厚区呈阳性,除增厚区表层细胞为阴性外,K14在其余区域表达较正常小鼠均显著增强,K10在增厚区表达呈阳性。3 Mycn基因敲除引起小鼠角膜混浊机制的初步研究对2W、6W及8W小鼠角膜上皮整合素β1和β4、E-钙粘素(E-cadherin)以及细胞周期蛋白D1(CyclinD1)免疫组织化学分析结果表明:Mycn基因敲除可能导致小鼠在角膜发育过程中角膜上皮细胞整合素β1、β4及Cyclin D1异常表达,对E-cadherin在角膜上皮中的表达则无明显影响(除眼睑开放型小鼠角膜上皮表层为阴性外)。结论:本研究首先通过Mycn基因敲除小鼠进一步验证了Myc 基因与角膜混浊的相关性并发现了Myc 基因敲除能够引起部分小鼠初生时眼睑开放。对Mycn基因敲除角膜混浊小鼠进行组织学特点研究后发现角膜上皮分化异常以及基质层出现新生血管是角膜混浊形成的关键因素。进一步摸索上皮分化异常机制后发现Mycn基因可能通过调控整合素β1、整合素β4以及Cyclin D1蛋白在角膜上皮中的表达进而影响角膜上皮分化。