论文部分内容阅读
FLORICAULA/LEAFY(FLO/LFY)同源基因时花发育的调节因子,处于花发育调控网络的中心节点。目前,大部分的LFY基因的研究都集中在开花植物中,但是LFY基因并不是开花植物所特有的,在不开的植物如苔藓中也存在。本研究以湿地藓(Hyophila javanica Brid.)为研究材料,通过PCR、RT-PCR、RACE结合Tail-PCR的技术,获得湿地藓LFY同源基因的cDNA序列、基因组DNA序列及启动子序列。通过生物信息学分析,对湿地藓LFY基因的结构,蛋白质的性质进行分析。并构建了LFY同源基因的系统进化树,对LFY同源基因进行进化分析。本研究开展了湿地藓LFY基因的原核表达分析,并对原核表达的条件进行优化,为后续蛋白质的纯化奠定基础。此外本研究还对湿地藓LFY基因的表达进行了实时荧光定量分析。本研究可以为揭示LFY基因在苔藓植物中的功能研究提供有价值的参考。本研究的主要结果如下:(1)利用RT-PCR结合RACE技术克隆了湿地藓LFY基因的完整基因片段,该基因全长为2633 bp,包括4个外显子与3个内含子,其cDNA全长为1402 bp和1219 bp(HjLFY1和HjLFY2)。其开放阅读框(ORF)为1050 bp,编码349个氨基酸。(2)利用ExPAsy在线软件ProtParam对湿地藓LFY蛋白进行预测,结果显示:该蛋白编码349个氨基酸,其相对分子质量为40389.07 Da,分子式为C1769H2825N511O535S18,等电点为6.59。此蛋白由20种氨基酸组成,其中,湿地藓LFY基因含量最丰富的氨基酸为Glu(10.6%),其次是Leu(9.5%),等电点为6.59,带负电氨基酸数目(Asp+Glu)=60,带正电氨基酸数目(Arg+Lys)=58,湿地藓LFY蛋白的不稳定系数为49.99,脂肪系数为75.67,平均亲水性系数为-0.759。利用PSIPRED在线软件对湿地藓LFY蛋白进行二级结构预测,结果显示:该蛋白的二级结构中无规则卷曲区、螺旋α螺旋区、β-延伸链交替出现,其中无规则卷曲区占比例最高,约为55.01%,其次是α螺旋区,约为41.26%,β-延伸链占比例最少,约为3.72%。(3)利用Tail-PCR技术克隆湿地藓LFY基因的启动子序列,获得821 bp的湿地藓LFY同源基因启动子序列。用PlantCARE在线工具对该启动子的顺式作用元件进行预测,结果表明该启动子除了含有核心启动子元件TATA-box和CAAT-box外,还含有光响应作用元件Sp1、生长素反应元件TGA element、参与干旱诱导的MYB结合位点(MBS)等其它顺式元件。(4)利用同源重组的方式成功构建了pThioHis A/LFY原核表达载体,获得了融合蛋白Trx-LFY,分子量约为53kD,符合预期目的蛋白大小。SDS-PAGE电泳检测表明该重组蛋白以2种形式存在,即部分可溶性表达形式及部分包涵体形式。进一步对该融合蛋白的表达条件进行筛选,以增加融合蛋白Trx-LFY的可溶性表达量,确定了其适宜的条件为:37℃培养至OD600=0.5,27℃诱导培养6小时,且IPTG的终浓度为1 mM。(5)通过荧光定量PCR的方法,对湿地藓LFY基因在不同组织的表达进行分析。结果表明湿地藓LFY基因在不同世代、不同组织(配子体世代的配子体、孢子体世代的配子体、孢子体世代的孢子体)中均有表达,其中,LFY基因在孢子体世代的孢子体中的表达量最高,其次是配子体世代的配子体,孢子体世代的配子体中的表达量最低。(6)对湿地藓植株进行脱水胁迫处理,其处理条件为0 h、0.5 h、1.5 h、2.5 h、3.5 h,通过荧光定量PCR的方法,对湿地藓LFY基因的表达进行检测,结果表明:LFY基因在干旱条件下,随着处理时间的变化,LFY基因的表达量变化幅度较大,3.5 h达到最高,约为对照组的1.4倍。