DMD基因变异导致的dystrophin蛋白缺陷引起的一组遗传性疾病称为dystrophinopathy。DMD基因定位在Xp21.2，编码蛋白dystrophin。男女均可发病，但男性患者占绝大多数，临床表型包括：杜兴型肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy, DMD）、贝克型肌营养不良（Beckermuscular dystrophy, BMD）（包括无症状高肌酸激酶血症、肌痉挛/肌痛、股四头肌肌病）、X连锁扩张型心肌病（X-linked dilated cardiomyopathy,XLDCM）、有/无症状DMD基因变异携带者。其中DMD是发病率最高、临床表现最重类型，多于5-6岁起病，表现走路慢，易摔倒，走路姿势异常，进展加重出现明显双下肢、腰带肌无力，蹲下站起、上下楼梯费力，约10-12岁左右不能行走，20-30岁死于心肺功能衰竭。BMD临床症状出现较DMD晚，可保持行走能力到16岁，病情进展相对缓慢，寿命较长。女性DMD基因缺陷携带者和邻近基因缺失女性患者临床表现差异巨大，重者可为典型DMD表现，轻者表现为轻度近端肌无力、腓肠肌假性肥大，甚至肌肉功能基本正常。Dystrophinopathy致病基因DMD至今仍是已发现的最大的基因，包含79个外显子，编码蛋白dystrophin，dystrophin蛋白包括4个不同的区域，氨基端与肌动蛋白（actin）或其相关蛋白相连，棒状端拥有长的24个膜收缩蛋白样（spectrin-like）重复区和位于两端的4个绞链区，胱氨酸富集区和羧基段选择性剪接区。Dystrophin蛋白连接细胞骨架与基底膜，并与其他蛋白（dystroglycan、sarcoglycan）形成肌营养不良糖蛋白复合体（dystrophinglycoprotein complex, DGC）维持细胞膜稳定性。基因变异导致整个蛋白复合体破坏使肌细胞膜脆性增加、稳定性破坏，强烈的肌肉收缩加剧肌细胞膜破坏使钙离子内流加速肌纤维的破坏。本研究从骨骼肌遗传资源标本库中筛选：1）部分dystrophinopathy患者进行分子病理和基因测序，重点选择2例有症状女性DMD基因变异携带者家系进行临床和基因变异分析；2）确诊的42例dystrophinopathy患者进行下肢骨骼肌MRI研究分析；3）DMD患者激素治疗分析，旨在对dystrophinopathy进行临床、影像、基因和激素治疗系列研究，发现临床、病理及分子生物学特点及治疗观察经验。第一部分Dystrophinopathy分子生物学研究目的：Dystrophinopathy是dystrophin蛋白结构、功能异常相关的一组遗传性骨骼肌疾病，致病基因DMD定位在Xp21.2，包含79个外显子，编码蛋白dystrophin。临床表型包括：Duchenne muscular dystroph（yDMD）、Becker muscular dystrophy（BMD）、X连锁扩张型心肌病（X-linked dilatedcardiomyopathy，XLDCM）、有/无症状DMD基因变异携带者。约8-22%的女性DMD基因变异携带者出现程度不同的肌无力表现，称为有症状携带者（manifesting carriers, MCs）。目前女性MCs发病机制尚未完全明确，倾斜的X染色体失活模式是目前研究热点。因病例较少尚未发现女性MCs基因热点突变，基因变异-X染色体失活-临床表现关系不明。本文对dystrophinopathy患者和2例女性MCs家系进行临床、骨骼肌病理和基因变异分析，旨在发现dystrophinopathy基因变异特点，重点探讨女性MCs的临床、基因变异特点及其可能的发病机制。方法：1临床病例入选标准：1）临床表现：缓慢进行性加重四肢近端肌、腰带肌无力、萎缩，腓肠肌假性肥大，Gower征（+）；2）高CK血症，肌电图呈肌源性损害；3）活检骨骼肌组织化学染色呈肌营养不良改变，抗-dystrophin-N，-C，-R单克隆抗体免疫组织化学染色dystrophin蛋白完全/部分缺失。2活检骨骼肌病理分析：入选病例行骨骼肌活检组织化学染色和抗dystrophin-N、-C、R单克隆抗体免疫组织化学染色病理分析。3DMD基因测序：多重PCR-DHPLC检测外显子缺失和重复突变，直接测序检测点突变。4女性MCs2例及家系临床和基因分析：4.1家系资料：选取有肢体近端肌无力、萎缩的2例女性患者，并且家族中有男性DMD/BMD患者的家系。4.2对家系患者及部分亲属行心电图、心肌核素显像及下肢肌肉MRI检查，评价心肌、骨骼肌受累情况。4.3骨骼肌活检组化和免疫组化染色：家系1先证者及家系2先证者及Ⅳ-4行开放式左肱二头肌活检病理分析（方法同上）。4.4核型分析：女性MCs和女性无症状携带者做常规GRQ带显色核型分析。4.5DMD基因测序：方法同上。4.6X染色体失活（X chromosome inactivation，XCI）分析：利用患者外周血DNA的扩增雄激素受体（androgen receptor，AR）区域，根据等位基因AR区域CpG数量不同，可区分父母X染色体。HpaII限制性内切酶消化作用确定其父母双方的X染色体的活性。结果：1临床资料：80例dystrophinopathy患者中，DMD患者67例，BMD患者10例，女性MCs2例，无症状高CK血症1例。2骨骼肌活检组化和免疫组化病理：全部病例活检骨骼肌组织化学染色呈肌营养不良改变，轻重程度与病程相关；抗dystrophin-N、-C、-R单克隆抗体免疫组织化学染色肌细胞膜dystrophin蛋白完全（67例）/部分缺失（13例）。3基因测序：14例dystrophinopathy患者行DMD基因测序分析：1例BMD未发现致病基因突变，1例DMD患者发现点突变c.4178T>A，余12例患者发现DMD外显子缺失突变。4女性MCs2例及家系临床和基因研究4.1临床表现：2个家系均呈X-连锁隐性遗传，先证者均表现不同程度肢体近端肌无力，无明显腓肠肌肥大。家系1先证者发病晚，临床症状较轻，家系2先证者发病早症状较重。4.2家系患者心肌受累情况：家系1先证者心电图和心肌核素显像未见异常。家系2先证者心肌核素显像：心尖处血流灌注轻度降低，左室射血分数：70%，左室结构和功能大致正常。4.3下肢肌肉MRI：家系1先证者：下肢肌肉受损不对称，肌群受损与DMD相似。家系2先证者：仅股薄肌、伸踇长肌、屈趾长肌相对保留，剩余肌肉均被脂肪和结缔组织替代。家系2Ⅳ-4肌群受损与BMD相似。4.4骨骼肌活检组化和免疫组化病理：2个家系先证者和家系2Ⅳ-4活检骨骼肌病理均为肌营养不良改变，抗dystrophin-N、-C、-R单克隆抗体免疫组织化学染色，肌纤维膜dystrophin蛋白在部分肌细胞膜上缺失/减弱，家系1先证者肌纤维膜dystrophin蛋白部分缺失呈马赛克样分布；家系2两名患者dystrophin-N、-R端完全缺失，-C表达减弱。4.5核型分析：家系1先证者和家系2先证者和Ⅱ-5、Ⅲ-7常规GRQ带染色体核型分析为正常女性核型。4.6DMD基因测序：家系1先证者和Ⅱ-7发现外显子61杂合性缺失。家系2先证者、Ⅱ-5和Ⅲ-7发现外显子12-43杂合性缺失，家系2Ⅳ-4发现外显子12-43纯合性缺失。2例先证者未发现有临床意义点突变。4.7XCI分析：家系1先证者、家系2先证者和Ⅲ-7X染色体失活检测均不能区分父母的等位基因(uninformative)。结论：1活检骨骼肌组织化学、抗-dystrophin单克隆抗体免疫组织化学染色病理分析有助于临床诊断dystrophinopathy，指导目的基因分析，判断临床表型和疾病预后。2对于临床诊断dystrophinopathy，基因分析首选片段缺失/重复筛查，再行点突变检测。3女性MCs临床症状严重程度与发病年龄有关，与骨骼肌病理像轻重程度相对应，与dystrophin蛋白表达无关。4女性MCs2例及家系均DMD基因外显子片段缺失，均未检测到具有临床意义点突变，女性MCs应常规进行核型和XCI分析；女性MCs临床表型-基因变异不符合阅读框学说，男性患者基因变异-临床表型多数符合阅读框学说。第二部分Dystrophinopathy下肢骨骼肌MRI研究目的：Dystrophinopathy主要发病机制为肌细胞骨架蛋白dystrophin缺失、肌细胞稳定性破坏，持续肌细胞变性、坏死和再生，结缔组织增生，随病程进展，单位容积肌细胞数目减少，脂肪组织替代。研究发现DMD患者肌肉损害T1加权成像表现为肌肉组织中出现短T1信号，压脂呈低信号，说明肌肉组织间脂肪组织浸润，随病情进展脂肪浸润程度增加，并表现出特异性选择性肌肉损害：大腿股薄肌、缝匠肌及半膜肌相对保存，股四头肌、比目鱼肌、腓肠肌损害明显，其中腓骨肌受损是DMD肌肉损害的特征之一。分析2004-2012年我科确诊的42例dystrophinopathy患者临床、下肢骨骼肌MRI特点，旨在总结、分析选择性肌群受累特点，探索分子影像学水平dystrophinopathy的诊断要点，及其与其它类型PMD的鉴别诊断要点。方法：1研究对象入组标准：1）儿童、青少年起病，下肢近端肌无力、肌萎缩，腓肠肌假性肥大，Gower征（+）；2）血CK显著升高，肌电图呈肌源性损害；3）肱二头肌活检组织化学染色病理分析大量的肌纤维变性、坏死和再生，结缔组织增生；抗dystrophin-N，-C，-R单克隆抗体免疫组化染色，肌细胞膜dystrophin蛋白完全缺失诊断DMD，部分缺失诊断BMD。2归纳分析42例入组患者临床资料，包括：性别、发病年龄、血肌酸激酶值，半定量评估、统计学分析下肢近/远端肌力，大小腿骨骼肌MRI受累肌群。3总结分析dystrophinopathy下肢骨骼肌MRI受累肌群特点及与临床表现相互关系。结果：1临床资料：下肢肌力与年龄呈负相关(大腿：r=-0.550, P=0.001<0.05,小腿：r=-0.400, P=0.021<0.05），近端肌力与远端肌力呈正相关（r=0.642,P<0.01）。2选择性肌群受累程度分析：DMD组下肢骨骼肌MRI，大腿肌肉受累程度重于小腿（P<0.001）；大腿肌群损害出现早且重于小腿。大腿肌群中股薄肌受累程度最轻，半腱肌次之，前群肌中股外侧肌最重；小腿肌群中胫骨前肌受累程度最小，后群肌中腓肠肌外侧头受累重于比目鱼肌和腓肠肌内侧头，前群肌中腓骨长肌受累最重。6例BMD肌群受累特点与DMD相似，1例无症状高CK血症和1例DMD基因缺陷携带者仅在股四头肌和腓肠肌呈轻度受累。3肌肉受累程度与临床资料对比分析：血CK与下肢肌肉受损程度无相关性（P=0.266>0.05）。大腿肌群与小腿肌群损伤程度均与年龄存在正相关性（大腿： r=0.720，P=0.009<0.05；小腿： r=0.680，P <0.01）；下肢近端肌力与大腿肌肉损伤程度存在负相关性（r=-0.611, P <0.01），远端肌力与小腿肌肉损伤程度存在负相关性（r=-0.462，P=0.012<0.05）。结论：1Dystrophinopathy患者下肢骨骼肌MRI存在特征性选择性肌群受累，受累特点与临床表现相对应，甚至在亚临床期MRI即可呈现肌肉损害特点。2Dystrophinopathy下肢骨骼肌MRI选择性肌群受累具有一定的规律性，此特点有助于分子影像水平诊断dystrophinopathy，鉴别诊断其他类型进行性肌营养不良，提示临床分型、指导致病基因测序。3下肢骨骼肌MRI可以客观评价dystrophinopathy患者病情，根据受累肌群特点指导康复治疗，评估药物治疗疗效。第三部分杜兴型肌营养不良糖皮质激素治疗分析目的：DMD是进行性肌营养不良中发病率最高的类型。约10-12岁左右不能行走，20-30岁死于心肺功能衰竭。血肌酸激酶（creatine kinase，CK）显著增高数十至数百倍，肌电图呈肌源性损害。目前DMD无有效的根治方法，主要以保存患者运动功能、防治并发症为治疗目的，包括：糖皮质激素治疗、适当康复锻炼及外科矫形等。其中糖皮质激素治疗是国内外公认的可延缓患者肌力丧失速度，保存运动功能，提高生活质量的药物。回顾性分析96例DMD患者临床、实验室表现，评判糖皮质激素治疗效果。方法：1研究对象入组标准：诊断基于：明显的下肢为主的肌无力、肌萎缩，血CK显著升高，肌电图呈肌源性损害，肱二头肌活检组织化学染色大量的肌纤维变性、坏死和再生，结缔组织增生，抗dystrophin-N，-C，-R单克隆抗体免疫组化染色，肌细胞膜dystrophin蛋白完全缺失。2分组及激素治疗方法：根据首诊年龄进行分组，再根据体重、年龄及血CK水平给予地塞米松5-10mg静脉输液治疗10-15天复查血CK，继续给予口服醋酸泼尼松0.5-0.75mg/kg.d维持治疗，1月后复查血CK，继续醋酸泼尼松维持治疗。3统计学分析激素治疗前后患者血CK、下肢运动功能变化。4评估患者心肌受累程度及智能水平。结果：1临床资料：初诊DMD患者，就诊年龄10个月-16岁，平均6.61士2.68岁。≤3岁组就诊原因主要为高肌酸激酶血症、阳性家族史；4-5岁组多以走路姿势异常就诊，6-8岁组以易摔倒、蹲起困难为主要就诊原因。发现阳性家族史10例，其余为散发病例。肌电图上、下肢均呈典型肌源性损害，近端肌为重。2血肌酸激酶：初诊患者血CK均显著升高，在≤3岁、5岁和8岁分别出现3个高峰，平均CK峰值≤3岁组>5岁组>8岁组，8岁后随年龄增长CK水平反而逐年下降。地塞米松治疗后CK均大幅度下降，继续醋酸泼尼松维持治疗1月后血CK明显复升。3下肢运动功能：50例患者醋酸泼尼松治疗后运动能力较治疗前改善（蹲起P=0.032，上下楼梯P=0.014）,包括24例接受间断静脉激素治疗患者。4心肌核素显像：37例心肌显像示心室肌放射性核素分布明显不均匀，呈“花斑样”改变，21例轻度受损，9例中度受损，7例重度受损，其中下间隔（14例）受累最多，前间隔受累最少（3例），心肌受损程度与年龄成正相关（P<0.01，rs=0.685）。5智能评估：24例DMD患者言语、操作能力及总体智商水平均较同年龄儿童低下（P<0.01），言语及操作能力发育无显著性差异（P=0.259>0.05），二者发育平衡。结论：1DMD为发病率最高的进行性肌营养不良，6-7岁为首诊高峰年龄组，多以走路姿势异常为首发症状，随病情进展出现易摔倒、跑步慢及上下楼梯、蹲起困难等临床表现。2DMD患者亚临床阶段即存在高CK血症、心肌损害，心肌损害程度与年龄成正相关；DMD患者存在智能损害，总体智商水平低下。3上述激素治疗后患者下肢运动功能较前改善，静脉激素可短时间降低血CK水平，口服小剂量激素不能降低血CK水平。4糖皮质激素治疗对维持DMD患者运动功能、延长行走时间、保护心功能有效。