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研究背景近年的研究发现,原发性醛固酮增多症(Primary Aldosteronism,PA)的患病率远高于人们以往认识的水平,并且与年龄、性别及血压水平匹配的原发性高血压患者相比,PA患者的心血管病患病率及死亡率显著升高,但机制尚不明确。脂肪组织炎症和纤维化参与了心血管疾病的发病机制,PA患者长期高醛固酮水平是否直接刺激脂肪组织炎症及纤维化而参与其心血管病发生机制尚不明确。目前有关PA患者不同部位脂肪组织炎症和纤维化的研究尚较少。研究目的本研究拟初步评估醛固酮瘤(Aldosterone-producingadenoma,APA)及非肾上腺占位疾病(Non-adrenal-disease,NAD)患者不同部位脂肪组织的炎症、纤维化及脂肪因子的表达情况,为进一步探讨PA患者心血管风险增加的可能机制提供理论的依据。研究方法分成三部分内容:1.探讨APA患者不同部位脂肪组织特性及炎症和纤维化情况分为原发性醛固酮增多症组(APA)及非肾上腺占位组(NAD)。NAD患者包括正常血压组(Normotension,NT)及原发性高血压组(Essential hypertension,EH)。提取APA者肾上腺周围脂肪组织(n=14)、肾周脂肪组织(n=6)、腹膜外脂肪组织(n=8)及皮下脂肪组织(n=9),NT组患者肾周脂肪(n=7)及皮下脂肪组织(n=6),EH患者肾周脂肪(n=5)及皮下脂肪组织(n=5)总RNA。RT-PCR方法检测上述组织中白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、早期生长反应因子1(EGR1)、金属蛋白酶类组织抑制剂(TIMP1)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、纤维连结蛋白(FN)、1型胶原蛋白(COLI)、转化生长因子-β1(TGFβ1)、脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)、环氧化酶2(COX2)及脂肪因子PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、UCP1、PRDM16、PGC1α、CIDEA,及内参基因 18S mRNA的表达。Westem Blot检测APA及EH组患者肾周脂肪组织中IL-6蛋白的表达。免疫组织化学检测TNF-α在APA及NT组、EH组患者肾周脂肪组织中的表达。Masson染色检测APA及NT组患者肾周脂肪组织胶原。2.探讨醛固酮刺激下SVF细胞功能变化分离非肾上腺占位患者肾周脂肪组织基质血管成分细胞(SVF)并进行体外原代培养并诱导分化,分化达到80%以上后饥饿过夜后10nMol/L醛固酮刺激24h后提取细胞总RNA,RT-PCR检测炎症因子,纤维化指标及脂肪因子的变化。3.探讨醛固酮对体外培养的脂肪细胞作用体外培养小鼠成纤维细胞(3T3-L1)及小鼠前棕色脂肪细胞WT-1,分化全程及分化成熟后使用10nMol/L醛固酮进行刺激后提取细胞总RNA,RT-PCR检测上述指标。结果1.APA患者不同部位脂肪组织特性及炎症和纤维化情况1.1.APA患者不同部位脂肪组织炎症及纤维化因子的表达APA患者肾周脂肪组织炎症因子IL-6、TNF-α及纤维化因子EGR1、FN、COLI及TGFβ1 mRNA的表达显著高于NT组、EH组患者,差异有统计学意义(p<0.05)。APA患者肾周脂肪组织中MMP2及ATGL显著高于NT患者,差异有统计学意义(p<0.05)。TNF-α免疫组织化染色显示APA患者肾周脂肪组织中TNF-α表达显著高于NT及EH组(p<0.05)。Masson染色结果显示与NT及EH组比较,APA患者肾周脂肪组织中胶原纤维明显增加(p<0.05)。Westem Blot结果显示APA患者肾周脂肪组织中IL-6蛋白表达高于EH组患者,差异有统计学意义(P<0.05)。1.2 APA患者不同部位脂肪组织脂肪因子的表达APA患者肾周脂肪组织中脂肪因子PPARγ、C/EBPα及C/EBPβ、UCP1、PGC1α及CIDEA显著高于NT组、EH组患者,差异有统计学意义(p<0.05)。APA患者皮下脂肪组织C/EBPβ、PGC1α及CIDEA mRNA显著高于NT组、EH组患者,差异有统计学意义(p<0.05)。2.醛固酮刺激下SVF细胞功能变化10nMol/L醛固酮刺激分化成熟人肾周脂肪SVF细胞可显著促进IL-6、及EGR1、FN、COLI、TGFβ1、MMP2、ATGL 的 mRNA 的表达,并显著增加 PPARγ、C/EBPα及PGC1α、CIDEA mRNA的表达,差异有显著统计学意义(p<0.05)。3.醛固酮对体外培养的脂肪细胞作用3.1 10nMol/L醛固酮对白色脂肪细胞3T3-L1的影响3.1.1 10nMol/L醛固酮对3T3-L1细胞分化过程的影响10nMol/L醛固酮分化全程刺激3T3-L1细胞显著增加PPARy、C/EBPα及C/EBPβ mRNA的表达,差异有统计学意义(p<0.05)。并显著促进ATGL及 IL-6、TNF-α、EGR1、FN、COLI 及 TGFβ1 mRNA 的表达,差异有统计学意义(p<0.05)。3.1.2 10nMol/L醛固酮对分化成熟3T3-L1细胞的影响10nMol/L醛固酮可显著刺激分化成熟3T3-L1细胞PPARγ、C/EBPα及UCP1、PGC1α mRNA的表达,差异有统计学意义(p<0.05)。并显著增加ATGL 及 IL-6、TNF-α、EGR1、FN、COLI 及 TGFβ1 mRNA 的表达,差异有统计学意义(p<0.05)。3.2 10nMol/L醛固酮对棕色脂肪细胞WT-1的影响3.2.1 10nMol/L醛固酮对WT-1细胞分化过程的影响10nMol/L醛固酮全程刺激WT-1细胞可显著增加PPARγ、C/EBPα及UCP1、PGC1α及 IL-6、TNF-α、FN、COLI 及 TGFβlmRNA 的表达,差异有显著统计学意义(p<0.05)。3.2.2 10nMol/L醛固酮对分化成熟WT-1细胞的影响10nMol/L醛固酮可显著刺激分化成熟WT-1细胞PPARy、CEBPα及UCP1、PC1αmRNA的表达,差异有统计学意义(p<0.05)。并显著增加ATGL及 IL-6、TNF-α、EGR1、FN、COLI 及 TGFβ1 mRNA 的表达,差异有统计学意义(p<0.05)。结论本研究结果提示,与非肾上腺占位的正常血压患者及原发性高血压患者比较,原发性醛固酮增多症患者其肾周脂肪组织及皮下脂肪组织中炎症及纤维化因子的表达均上调,进一步检测脂肪因子提示APA患者肾周及皮下脂肪组织中脂肪因子的表达亦发生改变。醛固酮刺激人类肾周脂肪组织来源SVF细胞体外实验结果进一步证实醛固酮刺激分化成熟人肾周脂肪组织SVF细胞炎症及纤维化因子mRNA表达的上调,并影响脂肪因子mRNA的表达。体外实验中,醛固酮刺激小鼠前白色脂肪细胞3T3-L1及小鼠前棕色脂肪细胞WT-1的实验结果进一步证实醛固酮可促进3T3-L1及WT-1细胞分化,并增加分化成熟的3T3-L1及WT-1细胞炎症及纤维化因子基因的表达。提示醛固酮刺激可导致脂肪组织功能紊乱,并导致其炎症及纤维化,可能与PA患者长期醛固酮刺激下心血管风险增加机制有关。