拟南芥是植物基因工程、生物技术研究的重要模式植物,随着拟南芥的深入研究,为各种农作物转基因技术的进一步研究提供了理论依据。高等植物生长发育的各过程是一个复杂的基因调控过程,这些过程的起始是启动子发挥作用的。启动子就是基因调控的开关,启动子异常对于植物的生长发育具有巨大的影响。随着生物化学与分子生物学技术及基因工程等技术的不断发展,启动子的功能及启动子上的作用元件的研究成为生物学研究热点。本实验室分析TAIR网站(https://www.arabidopsis.org/)上发布的基因注释信息,发现AT3G21380基因是一个甘露糖结合凝集素超家族蛋白(Mannose-binding lectin superfamily protein),我们将其命名为AtMBL1,进一步实验分析确定AtMBL1启动子是种子特异性表达启动子。本研究中对AtMBL1启动子序列进行组织特异性元件分析,发现存在四个RY元件,将之前克隆的AtMBL1启动子序列进行定点突变、酶切,之后连接到植物表达载体上,利用农杆菌介导的侵染法将其侵染到野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana var Columbia)。收取成熟的种子,将其撒到含有抗生素潮霉素B(Hygromycin B)的MS培养基上筛选出纯合纯系。然后再用GUS组织化学染色法对筛选到的野生型纯合株系及四个突变启动子纯合株系的各个时期进行染色观察,将这四个突变启动子的染色结果与At MBL1天然启动子进行比对分析,然后对野生型及四个突变启动子纯合株系的种子期进行GUS酶活性测定。本研究的主要实验结果如下:(1)AtMBL1启动子及各RY元件序列分析。首先利用生物软件分析天然AtMBL1启动子的RY元件位点,确定了RY1、RY2、RY3、RY4四个RY元件。(2)AtMBL1启动子各突变序列植物表达载体的构建。通过Primer5引物设计软件对各RY元件进行定点突变引物设计,以天然启动子为模板进行两步PCR扩增实验获得各突变启动子序列,产物进行凝胶电泳分析条带正确之后与表达载体进行连接,连接后的重组质粒产物进行双酶切及测序验证,最终获得连接有突变RY序列的表达载体。(3)各突变序列GUS染色分析。本实验室之前通过GUS组织化学染色情况验证了AtMBL1天然启动子是一个种子特异性启动子,即只有种子期有染色,四叶幼苗期、花期、角果期并未出现染色情况。故本研究对对各突变序列进行GUS染色。PMUTRY1-GUS、PMUTRY2-GUS、PMUTRY3-GUS、PMUTRY4-GUS四个突变序列转基因纯系的GUS染色在种子期均未出现染色现象,结果表明RY元件突变后At MBL1启动子的基因表达下调,即RY元件调控起正向调控作用。说明RY元件对At MBL1启动子的基因转录活性有重要作用。因在组织化学染色实验中,含有四个突变启动子的转基因株系均未染成蓝色,因此不能根据该染色结果确定四个RY元件的具体作用,即四个RY元件对启动子活性的贡献大小。虽然在突变启动子转基因株系种子里没有染色,但是四叶幼苗期、花期及角果期出现轻微染色现象,表明启动子突变RY元件之后驱动GUS报告基因在其他部位表达。因此我们推测RY元件可能对启动子驱动基因在其他组织中的表达起抑制作用,或者可能RY元件的突变影响了其他顺式作用元件从而出现非种子特异性表达现象的出现,对这一结果需进一步实验进行验证。(4)天然启动子及各突变启动子的GUS酶活性分析。利用反应产生的荧光物质的多少来定量检测GUS含量。测定天然及各突变启动子种子期的GUS酶活,结果显示相对于天然启动子而言,各突变启动子的GUS酶活性均显著降低,说明RY1、RY2、RY3、RY4四个顺式元件均能够驱动下游GUS基因的表达,在AtMBL1启动子中起着正向调控功能;同时,对四个突变启动子GUS酶活性降低程度比较,结果为PMUTRY3-GUS>PMUTRY2-GUS>PMUTRY2-GUS>PMUTRY4-GUS,因此我们得出结论:在AtMBL1启动子中,起主要正调控作用的是RY3元件,其次为RY2、RY1和RY4。