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背景
乳腺癌是女性癌症中发病率最高的疾病，严重危害女性健康。艾迪注射液具有清热解毒，消瘀散结功效，在临床广泛用于乳腺癌治疗，疗效确切，但由于其所含成分复杂，作用机制不清，极大地限制了艾迪注射液的临床应用和二次开发。
网络药理学是基于系统生物学理论，即通过对整体的全面分析进而了解整个复杂的生物系统的变化，探讨药物-靶标-疾病之间相互作用关系的学科。通过运用数据库筛选生物信息、构建生物网络、计算机虚拟计算、网络拓扑分析等研究策略，从系统水平上揭示药物对疾病的作用与机制，突破传统药理学研究主导的“一种药物，一个靶标”的理念，与中药多成分、多靶标、多层次治疗疾病的“整体观”思想不谋而合，因此，将网络药理学应用于中药作用机制研究具有独特的优势和巨大的发展潜力。本研究基于网络药理学研究策略，建立多靶标多层次的生物网络，结合基因功能注释和富集通路分析，预测艾迪注射液治疗乳腺癌的可能作用机制及靶标，通过细胞实验对预测机制及靶标进行反馈验证，为艾迪注射液的临床应用提供实验依据，也为中药复方的作用机制研究提供新思路。
目的
1.基于网络药理学的研究策略预测艾迪注射液治疗乳腺癌的作用机制及靶标。
2.基于网络药理学研究结果探讨艾迪注射液抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，进而抑制肿瘤生长；抑制细胞迁移，进而抑制肿瘤侵袭，最终发挥抗肿瘤的作用及具体分子机制。
3.反馈验证艾迪注射液是否通过调控蛋白质丝氨酸-苏氨酸激酶(Protein-serine-threoninekinase,Akt)/肿瘤蛋白53(Tumorprotein53,p53)和人有丝分裂原激活蛋白激酶1(Mitogen activated protein kinase 1, MAPK1)/核糖体S6激酶2(Ribosomal s6 kinase2, RSK2)通路治疗乳腺癌。
方法
1.通过TCMSP数据库、TCM@taiwan数据库及文献挖掘分别查询斑蝥(Mylabrisphalerata Pallas)、人参(Panaxginseng)、黄芪(Astragalus membranaceus)、刺五加(Acanthopanaxsenticosus)的活性成分并根据Lipinski五规则筛选其中AlogP＜5且DL≥0.18的化合物。合并4种药物的成分，删除重复，通过PharmMapper数据库查询每种成分对应的靶标，根据Score＞0.6筛选得到艾迪注射液的最终靶标。人乳腺癌基因通过OMIM及GeneCard数据库查询得到。药物靶标及疾病靶标运用UniProt数据库查询靶标对应的“Entry”，艾迪注射液靶标和乳腺癌靶标相映射并建立“成分-靶标”网络，映射所得的共同靶标通过DAVID数据库进行基因本体论(Gene ontology, GO)分析及京都基因与百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路分析；采用Cytoscape工具分别建立药物靶标及疾病靶标蛋白质相互作用网络(Protein–protein interactions,PPI)，取交集构建共同作用网络，通过CytoNCA的中间性中心度(Betweenness centrality, BC)、亲密度中心度(Closeness centrality, CC)、度中心度(Degreecentrality,DC)、特征向量中心度(Eigenvectorcentrality,EC)、网络中心度(Network centrality, NC)和基于局部平均连通性的方法(Local average connectivity-based method, LAC)6种中心度度量分析网络数据，根据Cytoscape中的聚类分析算法MCODE对核心目标PPI网络进行聚类分析，聚类分析结果输入DAVID数据库进行GO分析及KEGG富集分析，与共同靶标分析结果进行比较，预测靶标及作用机制。
2.基于网络药理学预测靶标及作用机制，采用人乳腺癌MDA-MB-231细胞进行实验验证，实验分组为对照组和艾迪给药组，给药浓度(v/v)分别为10%、15%、20%、25%、30%，通过细胞存活实验、凋亡实验、划痕实验、侵袭实验、线粒体膜电位实验及WesternBlotting验证艾迪注射液治疗乳腺癌的作用及机制。
3.对人乳腺癌MDA-MB-231细胞分别瞬时转染空质粒、Akt质粒、MAPK1质粒。细胞活性及凋亡实验分为对照组(Con)、空质粒组(pcDNA3.1)、空质粒+艾迪注射液给药组(pcDNA3.1+ADI)、过表达Akt+艾迪注射液给药组(pcDNA3.1-Akt+ADI)；细胞侵袭实验分为对照组(Con)、空质粒组(pcDNA3.1)、空质粒+艾迪注射液给药组(pcDNA3.1+ADI)、过表达MAPK1+艾迪注射液给药组(pcDNA3.1-MAPK1+ADI)；WesternBlotting实验分组为对照组(Con)、空质粒组(pcDNA3.1)、空质粒+艾迪注射液给药组(pcDNA3.1+ADI)、过表达Akt+艾迪注射液给药组(pcDNA3.1-Akt+ADI)、过表达MAPK1+艾迪注射液给药组(pcDNA3.1-MAPK1+ADI)。通过细胞活性检测、凋亡实验、侵袭实验及WesternBlotting验证艾迪注射液对过表达Akt及MAPK1的MDA-MB-231细胞的作用及机制。根据第二部分实验结果选择艾迪注射液作用浓度为15%(v/v)进行干预。
结果
1.网络药理学研究结果得到艾迪注射液与乳腺癌共同靶标108个，聚类分析预测关键靶标20个，调整P值缩小筛选范围确定3个核心靶标Akt1、MAPK1和周期蛋白依赖性激酶2(Cyclin-dependent kinases, CDK2)。GO分析发现艾迪注射液治疗乳腺癌涉及的生物学过程包括细胞凋亡、细胞迁移、血管新生、炎症反应、蛋白泛素化等。KEGG富集分析发现艾迪注射液作用乳腺癌的富集途径主要集中于癌症通路、ErbB信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体(Toll like receptors, TLR)信号通路、趋化因子信号通路、p53信号通路和细胞周期信号通路。
2.细胞实验结果显示艾迪注射液阻滞肿瘤细胞周期、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞线粒体膜电位下降；WesternBlotting结果显示，艾迪注射液显著降低Akt蛋白表达，下调其下游蛋白鼠双微体基因2(Murinedoubleminute2, MDM2)，上调p53、p21并抑制CDK2的蛋白表达，显著降低MAPK1及其下游蛋白RSK2的表达。提示艾迪注射液发挥抗肿瘤作用与抑制Akt/p53通路及MAPK1/RSK2通路有关。
3.与空质粒+给药组比较，艾迪注射液对过表达Akt的MDA-MB-231细胞无抑制增殖作用，无促进细胞凋亡作用，可抑制转染空质粒组中Akt的磷酸化水平，但不能抑制过表达Akt细胞中Akt的磷酸化和表达；艾迪注射液对过表达MAPK1的MDA-MB-231细胞无抑制侵袭作用，可抑制转染空质粒组中MAPK1的磷酸化水平，但不能抑制过表达MAPK1细胞中MAPK1的磷酸化和表达。提示艾迪注射液抑制Akt/p53信号通路，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，进而抑制肿瘤生长；抑制MAPK1/RSK2信号通路，进而抑制肿瘤侵袭。
结论
基于网络药理学预测结果显示，艾迪注射液的抗肿瘤作用可能与其作用于Akt1、MAPK1、CDK2三个靶标，影响细胞凋亡、细胞迁移、血管新生、炎症反应、蛋白泛素化等生物学过程及癌症通路、ErbB信号通路、MAPK信号通路、TLR信号通路、趋化因子信号通路、p53信号通路、细胞周期等信号通路。进一步的细胞实验结果提示艾迪注射液可能通过抑制Akt/p53信号通路，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，进而抑制肿瘤生长；抑制MAPK1/RSK2信号通路，进而抑制肿瘤侵袭，最终发挥治疗乳腺癌的作用，基本验证了网络药理学的研究结果。本研究将为艾迪注射液的临床应用及二次开发提供实验依据和理论参考。
乳腺癌是女性癌症中发病率最高的疾病，严重危害女性健康。艾迪注射液具有清热解毒，消瘀散结功效，在临床广泛用于乳腺癌治疗，疗效确切，但由于其所含成分复杂，作用机制不清，极大地限制了艾迪注射液的临床应用和二次开发。
网络药理学是基于系统生物学理论，即通过对整体的全面分析进而了解整个复杂的生物系统的变化，探讨药物-靶标-疾病之间相互作用关系的学科。通过运用数据库筛选生物信息、构建生物网络、计算机虚拟计算、网络拓扑分析等研究策略，从系统水平上揭示药物对疾病的作用与机制，突破传统药理学研究主导的“一种药物，一个靶标”的理念，与中药多成分、多靶标、多层次治疗疾病的“整体观”思想不谋而合，因此，将网络药理学应用于中药作用机制研究具有独特的优势和巨大的发展潜力。本研究基于网络药理学研究策略，建立多靶标多层次的生物网络，结合基因功能注释和富集通路分析，预测艾迪注射液治疗乳腺癌的可能作用机制及靶标，通过细胞实验对预测机制及靶标进行反馈验证，为艾迪注射液的临床应用提供实验依据，也为中药复方的作用机制研究提供新思路。
目的
1.基于网络药理学的研究策略预测艾迪注射液治疗乳腺癌的作用机制及靶标。
2.基于网络药理学研究结果探讨艾迪注射液抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，进而抑制肿瘤生长；抑制细胞迁移，进而抑制肿瘤侵袭，最终发挥抗肿瘤的作用及具体分子机制。
3.反馈验证艾迪注射液是否通过调控蛋白质丝氨酸-苏氨酸激酶(Protein-serine-threoninekinase,Akt)/肿瘤蛋白53(Tumorprotein53,p53)和人有丝分裂原激活蛋白激酶1(Mitogen activated protein kinase 1, MAPK1)/核糖体S6激酶2(Ribosomal s6 kinase2, RSK2)通路治疗乳腺癌。
方法
1.通过TCMSP数据库、TCM@taiwan数据库及文献挖掘分别查询斑蝥(Mylabrisphalerata Pallas)、人参(Panaxginseng)、黄芪(Astragalus membranaceus)、刺五加(Acanthopanaxsenticosus)的活性成分并根据Lipinski五规则筛选其中AlogP＜5且DL≥0.18的化合物。合并4种药物的成分，删除重复，通过PharmMapper数据库查询每种成分对应的靶标，根据Score＞0.6筛选得到艾迪注射液的最终靶标。人乳腺癌基因通过OMIM及GeneCard数据库查询得到。药物靶标及疾病靶标运用UniProt数据库查询靶标对应的“Entry”，艾迪注射液靶标和乳腺癌靶标相映射并建立“成分-靶标”网络，映射所得的共同靶标通过DAVID数据库进行基因本体论(Gene ontology, GO)分析及京都基因与百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路分析；采用Cytoscape工具分别建立药物靶标及疾病靶标蛋白质相互作用网络(Protein–protein interactions,PPI)，取交集构建共同作用网络，通过CytoNCA的中间性中心度(Betweenness centrality, BC)、亲密度中心度(Closeness centrality, CC)、度中心度(Degreecentrality,DC)、特征向量中心度(Eigenvectorcentrality,EC)、网络中心度(Network centrality, NC)和基于局部平均连通性的方法(Local average connectivity-based method, LAC)6种中心度度量分析网络数据，根据Cytoscape中的聚类分析算法MCODE对核心目标PPI网络进行聚类分析，聚类分析结果输入DAVID数据库进行GO分析及KEGG富集分析，与共同靶标分析结果进行比较，预测靶标及作用机制。
2.基于网络药理学预测靶标及作用机制，采用人乳腺癌MDA-MB-231细胞进行实验验证，实验分组为对照组和艾迪给药组，给药浓度(v/v)分别为10%、15%、20%、25%、30%，通过细胞存活实验、凋亡实验、划痕实验、侵袭实验、线粒体膜电位实验及WesternBlotting验证艾迪注射液治疗乳腺癌的作用及机制。
3.对人乳腺癌MDA-MB-231细胞分别瞬时转染空质粒、Akt质粒、MAPK1质粒。细胞活性及凋亡实验分为对照组(Con)、空质粒组(pcDNA3.1)、空质粒+艾迪注射液给药组(pcDNA3.1+ADI)、过表达Akt+艾迪注射液给药组(pcDNA3.1-Akt+ADI)；细胞侵袭实验分为对照组(Con)、空质粒组(pcDNA3.1)、空质粒+艾迪注射液给药组(pcDNA3.1+ADI)、过表达MAPK1+艾迪注射液给药组(pcDNA3.1-MAPK1+ADI)；WesternBlotting实验分组为对照组(Con)、空质粒组(pcDNA3.1)、空质粒+艾迪注射液给药组(pcDNA3.1+ADI)、过表达Akt+艾迪注射液给药组(pcDNA3.1-Akt+ADI)、过表达MAPK1+艾迪注射液给药组(pcDNA3.1-MAPK1+ADI)。通过细胞活性检测、凋亡实验、侵袭实验及WesternBlotting验证艾迪注射液对过表达Akt及MAPK1的MDA-MB-231细胞的作用及机制。根据第二部分实验结果选择艾迪注射液作用浓度为15%(v/v)进行干预。
结果
1.网络药理学研究结果得到艾迪注射液与乳腺癌共同靶标108个，聚类分析预测关键靶标20个，调整P值缩小筛选范围确定3个核心靶标Akt1、MAPK1和周期蛋白依赖性激酶2(Cyclin-dependent kinases, CDK2)。GO分析发现艾迪注射液治疗乳腺癌涉及的生物学过程包括细胞凋亡、细胞迁移、血管新生、炎症反应、蛋白泛素化等。KEGG富集分析发现艾迪注射液作用乳腺癌的富集途径主要集中于癌症通路、ErbB信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体(Toll like receptors, TLR)信号通路、趋化因子信号通路、p53信号通路和细胞周期信号通路。
2.细胞实验结果显示艾迪注射液阻滞肿瘤细胞周期、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞线粒体膜电位下降；WesternBlotting结果显示，艾迪注射液显著降低Akt蛋白表达，下调其下游蛋白鼠双微体基因2(Murinedoubleminute2, MDM2)，上调p53、p21并抑制CDK2的蛋白表达，显著降低MAPK1及其下游蛋白RSK2的表达。提示艾迪注射液发挥抗肿瘤作用与抑制Akt/p53通路及MAPK1/RSK2通路有关。
3.与空质粒+给药组比较，艾迪注射液对过表达Akt的MDA-MB-231细胞无抑制增殖作用，无促进细胞凋亡作用，可抑制转染空质粒组中Akt的磷酸化水平，但不能抑制过表达Akt细胞中Akt的磷酸化和表达；艾迪注射液对过表达MAPK1的MDA-MB-231细胞无抑制侵袭作用，可抑制转染空质粒组中MAPK1的磷酸化水平，但不能抑制过表达MAPK1细胞中MAPK1的磷酸化和表达。提示艾迪注射液抑制Akt/p53信号通路，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，进而抑制肿瘤生长；抑制MAPK1/RSK2信号通路，进而抑制肿瘤侵袭。
结论
基于网络药理学预测结果显示，艾迪注射液的抗肿瘤作用可能与其作用于Akt1、MAPK1、CDK2三个靶标，影响细胞凋亡、细胞迁移、血管新生、炎症反应、蛋白泛素化等生物学过程及癌症通路、ErbB信号通路、MAPK信号通路、TLR信号通路、趋化因子信号通路、p53信号通路、细胞周期等信号通路。进一步的细胞实验结果提示艾迪注射液可能通过抑制Akt/p53信号通路，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，进而抑制肿瘤生长；抑制MAPK1/RSK2信号通路，进而抑制肿瘤侵袭，最终发挥治疗乳腺癌的作用，基本验证了网络药理学的研究结果。本研究将为艾迪注射液的临床应用及二次开发提供实验依据和理论参考。