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哺乳动物中,CD226和CD96被命名为CD226亚家族,在介导免疫识别、细胞粘附和T细胞激活中发挥重要作用。但是,鱼类中CD226亚家族分子功能研究尚未见报道,为充分探究鱼类CD226亚家族基因及其配体的功能,本研究以重要经济鱼类罗非鱼为研究对象,对CD226亚家族分子及其配体进行克隆鉴定,并开展四个方面的研究:（1）qPCR检测健康罗非鱼和经过免疫刺激后的罗非鱼组织或细胞中,CD226、CD96及其共同配体Necl5的表达模式;（2）利用亚细胞共定位和酵母双杂交验证CD226、CD96与配体Necl5的相互作用;（3）通过CD226和CD96重组蛋白结合抗体孵育,研究了它们对罗非鱼头肾全淋巴细胞的增殖及下游相关效应因子表达的影响;（4）利用双荧光素酶报告实验检测它们参与的信号通路。结果如下:1.CD226和CD96均参与了罗非鱼抵御病原的免疫应答过程qPCR检测结果显示,OnCD226主要在健康罗非鱼的脑部表达,而OnCD96主要在胸腺表达。经无乳链球菌和poly I:C刺激后,OnCD226在胸腺,头肾和脾脏组织中极显著上调表达,其中胸腺于6 h达到表达高峰;OnCD96在胸腺,脾脏和脑部中也是极显著性上调表达,其中在脾脏中于24 h达到表达高峰。另外,经无乳链球菌,poly I:C和LPS刺激后,OnCD226和OnCD96在罗非鱼头肾全淋巴细胞中也是极显著上调表达,且大部分于96 h达到表达峰值。在经典的T细胞依赖性抗原血蓝蛋白（KLH）免疫后,OnCD226和OnCD96均上调表达,且二次免疫后上调表达时间早于首次免疫,但强度不总比首次免疫强。上述结果表明OnCD226和OnCD96均参与了罗非鱼对病原微生物侵袭的免疫应答过程,并很有可能介导了宿主对T细胞依赖性病原体感染的防御。2.CD226、CD96分别与配体Necl5发生蛋白互作亚细胞共定位结果显示,OnCD226,OnCD96均分别与OnNecl5在膜上发生共定位,表明OnCD226和OnCD96具有与OnNecl5相互作用的结构基础;通过酵母双杂交实验进一步验证,结果发现OnCD226/OnNecl5及OnCD96/OnNecl5在酵母双杂交水平发生蛋白互作,提示CD226和CD96与其共同配体Necl5的相互作用在鱼类中也保守存在并具有重要功能。3.OnCD226和OnCD96参与对下游效应因子的诱导表达细胞增殖实验结果表明,兔抗-OnCD226-ECD和兔抗-OnCD96-ECD对罗非鱼头肾全淋巴细胞的增殖具有增强作用,但OnCD226-ECD和OnCD96-ECD则无显著影响;但OnCD226-ECD和OnCD96-ECD均显著影响头肾全淋巴细胞的炎症因子（促炎因子TNF-α和抑炎因子IL-10）、细胞分化相关因子（Thl细胞:IL12、Th17细胞:IL-17、Terg细胞:Foxp3）、细胞表面标记分子（TCR-β和CD8）及配体OnNecl5的表达情况。4.CD226和CD96均显著激活NF-κB通路而抑制IRSE通路双荧光素酶报告实验结果显示,OnCD226,OnCD96和OnNecl5均有效激活了NF-κB通路,同时也上调了 IFN1和IFN3的表达,STAT1信号转导因子也相应被激活,有趣的是,IRSE干扰素激活反应元件却被抑制。表明CD226亚家族分子很有可能通过NF-κB以及干扰素等通路调节鱼体的免疫应答过程。