盐度影响金钱鱼卵巢发育分子机制的初步研究

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金钱鱼(Scatophagus argus)属于广盐性鱼类,生活在近海海域,繁殖季节会在河口地区进行繁殖,完成繁殖后返回近海,其生殖周期过程在不同盐度水域中完成。研究表明,金钱鱼雌鱼性腺指数(Gonadosomatic index:GSI)和血清雌二醇(17β-estradiol:E2)水平在25ppt中高于5ppt和35ppt,表明盐度在金钱鱼生殖过程中具有重要作用,但盐度在其卵巢发育的生殖调控中的分子作用机理仍不清楚。为此,本研究采用不同盐度处理成熟雌性金钱鱼,q PCR检测盐度对下丘脑-脑垂体-性腺中生殖相关基因、肝脏中vtg Aa、vtg Ab和vtg C和血清中E2的影响;采用mRNA、miRNA转录组测序分析盐度对卵巢中通路的影响以及筛选卵巢中生殖相关的差异表达基因(Differentially expressed gene:DEGs)和差异表达miRNA(Differentially expressed miRNA:DEMs);miRNA-mRNA联合分析并验证了sa-miR-9、sa-miR-3154对zp2,sa-miR-3533对zp3存在负调控作用。同时q PCR检测了zp2和zp3在组织分布、不同卵巢发育时期和E2腹腔注射中的表达。本论文得到主要结果如下:(1)不同盐度(5ppt,25ppt,35ppt)处理2龄性成熟(Ⅳ期和Ⅴ期)金钱鱼20 d后,卵巢在25ppt仍处于Ⅳ期和Ⅴ期,但在5ppt和35ppt盐度中卵巢退化为Ⅱ期和Ⅲ期;下丘脑中sbgnrh、lpxrfa和lpxrfa-r随着盐度升高而降低;脑垂体中lhβ在25ppt和35ppt表达显著高于5ppt,但脑垂体中的fshβ和卵巢中的fshr在各盐度间无显著性差异;卵巢中lhr、cyp17a1、cyp17a2、hsd3b1、hsd11b2、era和erβ2在25ppt条件下的表达显著高于其它两个盐度,star1的表达在25ppt显著高于35ppt,但cyp19a1b和hsd17b14在25ppt则显著低于其它两个盐度,ar和erβ1表现出随着盐度升高而升高的趋势;盐度处理20 d后,对照组25ppt中E2浓度与处理前无显著性差异,且E2在各盐度组间无显著性差异。肝脏中vtg Aa、vtg Ab和vtg C在5ppt的表达显著高于25ppt和35ppt。(2)以25ppt为对照,采用RNA-seq技术对5ppt、25ppt和35ppt处理20 d后的2龄性成熟雌性金钱鱼卵巢进行转录组分析发现,5ppt比较组(25ppt vs 5ppt)和35ppt比较组(25ppt vs 35ppt)的DEGs分别为1107个(上调54个,下调1053个)和547个(上调33个,下调514个)。GO和KEGG分析显示,不同盐度处理DEGs主要富集在胚胎发育、类固醇运输、丙酮酸代谢过程、激酶活性、钾运输ATP酶活性等条目以及ECM-receptor interaction、PI3K-Akt signaling pathway、Focal adhesion、MAPK signaling pathway等通路。筛选获得了与盐度处理影响生殖过程相关的DEGs,如lepr、wt1b、fgfr1a、sox4、sox9b、igfbp1、igfbp5、igfbp7、fstl1、zp2、zp3等。(3)以25ppt为对照组,5ppt、25ppt和35ppt处理20 d后的2龄性成熟金钱鱼卵巢组织进行miRNA测序分析发现,5ppt比较组和35ppt比较组的DEMs分别为193个(上调102个,下调91个)和258个(上调49个,下调209个)。预测的靶基因GO和KEGG分析显示,不同盐度处理DEMs预测的靶基因主要富集在细胞代谢过程、代谢过程、催化活性、核糖核苷类结合等条目以及Progesterone-mediated oocyte maturation、MAPK signaling pathway、TGF-βsignaling pathway、Wnt signaling pathway、Oocyte meiosis等通路。(4)miRNA-mRNA联合分析发现,不同盐度处理后,透明带(zona pellucida:ZP)蛋白家族中的zp2和zp3在25ppt卵巢中的表达显著低于5ppt和35ppt。组织分布发现,zp2和zp3主要在卵巢表达,在肝脏中不表达。zp2、zp3、sa-miR-9、sa-miR-3154和sa-miR-3533的表达随着卵巢发育而升高。在体E2注射能够显著上调卵巢中zp2、zp3和sa-miR-3154的表达。miRNA-mRNA负相关靶关系对验证发现,在不同盐度处理的金钱鱼卵巢中sa-miR-9、sa-miR-3154对zp2和sa-miR-3533对zp3有负调控作用。综上所述,环境盐度对金钱鱼HPG轴中和肝脏中生殖相关基因的表达有显著的影响;转录组分析获得了一批与环境盐度对卵巢发育和成熟相关GO条目和KEGG通路以及候选基因和miRNA;卵巢中sa-miR-9、sa-miR-3154对zp2,sa-miR-3533对zp3有负调控作用。这些结果表明盐度在金钱鱼生殖调控中具有重要作用。
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