乳腺癌是一种高度异质化的肿瘤,具有四种主要的分子亚型。不同分子亚型的乳腺癌对各种药物的治疗反应和预后差异较大。目前,临床乳腺癌分子分型主要依赖于病理检测的“金标准”——免疫组织化学技术(IHC),其操作费时、费力、成本高昂,已不能满足当前临床诊断的需要。所以,开发高效、快速、灵敏的乳腺癌分子分型新方法对提高乳腺癌的分子分型效率和准确率以及及时作出高效正确的乳腺癌治疗策略,降低乳腺癌病人的死亡率具有十分重要的现实意义。核酸适配体是在体外利用SELEX技术经过多轮筛选得到的能够和相应靶标特异性结合的短链RNA或者ssDNA。和抗体相比,核酸适配体具有特异性强、亲和性高、稳定性好、易修饰、成本低、靶标范围广等优点,被人们形象地称为“化学抗体”。近年来,核酸适配体在生物检测、分子诊断、生物成像、肿瘤分子分型以及药物输送等生物医学领域表现出巨大的应用潜力。在SELEX技术的基础上发展起来的以活细胞为筛选目标的Cell-SELEX技术可以在具体靶标未知的情况下筛选得到与特定肿瘤细胞特异性结合的核酸适配体。这种核酸适配体具有在一定条件下与天然构象的靶标高效结合的能力,克服了通过纯化靶标的SELEX技术获得的核酸适配体对天然靶标识别不灵敏的缺陷。本论文利用Cell-SELEX技术在体外经过连续21轮筛选得到了六条能够与人乳腺癌细胞SK-BR-3特异性结合的核酸适配体。系统考察了这六条核酸适配体的性质,然后经过序列优化后得到了具有人乳腺癌分子分型应用潜力的核酸适配体sk6Ea。主要内容如下:1.人乳腺癌细胞SK-BR-3特异性核酸适配体的筛选以人乳腺癌细胞SK-BR-3为靶细胞,乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231和人正常乳腺上皮细胞MCF-10A为对照细胞,利用Cell-SELEX技术在体外经过连续21轮筛选后,克隆次级文库,随机挑取30个克隆子进行测序,最终得到了能够和人乳腺癌细胞SK-BR-3特异性结合的六条核酸适配体,并对其二级结构进行了预测,这六条核酸适配体的二级结构中均具有明显的茎环结构。2.核酸适配体的性质考察及其序列优化系统地考察了所得六条核酸适配体的具体性质,重点考察了其特异性和亲和力大小。对其中特异性最强、亲和力最大的核酸适配体序列6进行了序列优化,得到新的长度为53 nt的核酸适配体sk6Ea。随后,进一步研究了核酸适配体sk6Ea的特异性和亲和力大小以及不同温度和不同酶消化对核酸适配体sk6Ea与靶细胞SK-BR-3结合能力的影响。结果表明:核酸适配体sk6Ea特异性强,能够区分靶细胞SK-BR-3和多种其他肿瘤细胞与正常细胞,其与靶细胞的结合解离常数Kd值大小为49.32 ± 14.53 nM;在4 ℃、25 ℃和37 ℃三个不同温度条件下,sk6Ea均能与靶细胞SK-BR-3结合良好,差异不明显。用胰酶和蛋白酶K消化靶细胞后,核酸适配体sk6Ea与靶细胞的结合能力显著降低,这说明核酸适配体sk6Ea与靶细胞膜上结合的具体靶标可能为一种膜蛋白,为进一步鉴定sk6Ea的靶标提供了参考依据。3.核酸适配体在人乳腺癌分子分型中的应用分别在细胞水平、组织水平和动物活体成像三个不同层面考察了核酸适配体sk6Ea应用于人乳腺癌分子分型的可能性。结果表明:核酸适配体sk6Ea能够显著鉴别人乳腺癌细胞SK-BR-3和MCF-7、MDA-MB-231以及人正常乳腺上皮细胞MCF-10A;在组织水平上能够鉴别HER2过表达型乳腺癌与Luminal A型、Luminal B型和三阴性乳腺癌四种乳腺癌分子亚型以及人正常乳腺组织。在动物活体内成像研究中,核酸适配体sk6Ea能够在体内成功鉴别SK-BR-3移植瘤和MCF-7移植瘤。同时,核酸适配体sk6Ea在SK-BR-3移植瘤小鼠体内的生物分布研究结果显示,核酸适配体在瘤体部位的富集明显强于肾脏、肝脏、肺脏、脾脏和心脏。以上结果初步表明,核酸适配体sk6Ea具有人乳腺癌分子分型和体内应用研究的潜力。