肝外胆管癌(通常称为胆管癌)因早期诊断困难，手术切除率低、预后差而成为胆道外科研究的热点课题之一。胆管癌是一种发病率很低的恶性肿瘤，但是近年来有升高的趋势；而且对标准化治疗(包括化学疗法，放射疗法和手术疗法)的反应较差。因此国内外的研究者对胆管癌发生发展的分子生物学机制十分关注，进行了大量的研究，而这对于胆管癌的早期诊断，综合治疗和判断预后有着重要的指导意义。 细胞增殖和凋亡失衡是肿瘤发生发展的重要机制，凋亡调节基因被认为是继原癌基因、抑癌基因之后的第三类癌基因。Livin是IAPs(IAP)家族中的最新成员，于2000年采用IAP同源序列(BIR或RING)寻找的方法，分别从人类基因组cDNA文库中克隆得到。Livin在多种肿瘤组织中均表达上调，而在正常组织中不表达或低表达，提示其可能与肿瘤的发生、发展有关。研究显示Livin与白血病细胞的耐药有关；抑制Livin基因表达可抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡及对常见促凋亡因素如化疗药物、放疗等具有增效作用，Livin可能成为肿瘤治疗的一个新的靶点。但是国内、外目前有关Livin基因在胆管癌发生、发展以及预后中作用的研究报道极少。 近年发展起来的RNA干扰(RNAi)技术能高效抑制目的基因表达，RNAi是一种古老的保守现象，在体内涉及多个步骤：长dsRNA由核酸内切酶(RNaseⅢ，或称Dicer)切割成21～23bp小干扰RNA(siRNA)后者再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、螺旋酶)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)，RISC与目的基因按碱基配对原则结合后对mRNA进行降解。在哺乳动物细胞通过人为地引入合成的21～23bp双链RNA就能起到siRNA作用，从而诱导内源靶基因的mRNA降解，达到阻止基因表达的目的。因此应用RNAi技术抑制某一异常基因表达将可能用于病毒、肿瘤等疾病的治疗。本研究若能证实Livin基因在胆管癌的发生发展和判断预后方面有重要的作用，将设计以Livin基因为靶标的siRNA，试探Livin-siRNA对人胆管癌细胞体外增殖及凋亡的影响，从而为胆管癌的基因治疗提供新的理论基础。 本研究的第一部分，利用RT-PCR、免疫组化法检测了Livin在人胆管癌组织及胆管癌细胞系中的表达情况，初步阐明Livin基因与胆管癌发生发展之间的关系；第二部分，利用化学合成的siRNA分子在体外抑制人胆管癌细胞系QBC939中Livin基因的表达，观察Livin基因抑制后对人胆管癌细胞体外增殖、凋亡及侵袭性的影响，初步探讨利用RNAi技术抑制Livin基因表达在胆管癌治疗中的潜在意义。 第一部分Livin在人胆管癌组织及胆管癌细胞系中的表达和意义 目的：探讨Livin基因在人胆管癌组织及胆管癌细胞系中的表达情况，初步分析Livin基因与胆管癌发生发展之间的关系。 方法：收集了45例人胆管癌组织及及20例非癌胆管组织标本切片，采用免疫组织化学技术(SP法)检测Livin蛋白分别在上述标本中表达情况，分析Livin蛋白表达与胆管癌临床病理特征的关系。同时采用RT-PCR法及SP法分别在mRNA和蛋白水平检测了Livin在人胆管癌细胞系QBC939表达情况，并以非肿瘤细胞系HT-1080作为对照。 结果：45例人胆管癌组织中，57.8％的病人(26例)的癌组织中特异性表达，而非癌胆管组织中未能检测到Livin表达，差异有统计学意义。Livin表达于肿瘤细胞细胞浆中，并且Livin主要在肿瘤细胞中表达，而周围的炎性细胞及间质中无表达。Livin表达与性别、年龄、肿瘤大小及肿瘤分化程度无关，Livin在有淋巴结转移患者中的表达较无淋巴结转移患者中的表达高，差异有显著性意义。在人胆管癌细胞QBC939中，LivinmRNA及蛋白均特异性表达，而非肿瘤细胞系HT-1080未见Livin表达。 结论：Livin基因在人类胆管癌组织和细胞系中选择性高表达，Livin可能是胆管癌发生发展中的一个关键基因，提示Livin可以应用于胆管癌的病理诊断中，以Livin为靶向的治疗有望成为胆管癌治疗的新靶点和新途径。 第二部分Livin特异性siRNA对人胆管癌细胞生物学特性影响的实验研究 目的：筛选出有效抑制Livin基因表达的siRNA片断，观察siRNA抑制人胆管癌细胞QBC939中Livin基因表达后对其体外增殖、凋亡及侵袭性的影响。 方法： 1、按照siRNA的合成原则，设计三对siRNA分子，由上海吉玛公司合成，分别称为siRNA-liv294、siRNA-liv648和siRNA-liv541，合成后在Genebank中进行BLAST，排除与其他基因同源。利用转染试剂RNAi-mate分别转染入QBC939细胞。 2、三对160nM浓度的siRNA转染细胞48h后，检测其在mRNA水平上对QBC939细胞中Livin基因表达的抑制作用，筛选最有效的序列进行下一步实验。并观察该最有效的siRNA在160nM浓度下于不同时间点对Livin基因mRNA及蛋白表达抑制作用的变化。 3、siRNA转染后对QBC939生物学特性影响：QBC939细胞被分为三组：阴性对照组、RNAi-mate组、siRNA-liv648组，各组siRNA在脂质体RNAi-mate介导下转染相应的细胞。采用流式细胞仪测定转染相应siRNA分子48h后各组QBC939细胞凋亡率和细胞周期的变化；转染siRNA48h后，比色法及Boyden小室法分别测定各组QBC939细胞Caspase-3活性及侵袭性变化。 结果： 1、RNAi-mate可有效地将siRNA分子转染至QBC939细胞内；160nM浓度的siRNA-liv648转染细胞48h后，可观察到其对Livin基因有明显抑制作用，抑制率达68.2％；而siRNA-liv294及siRNA-liv541在上述浓度下对Livin基因无明显抑制作用。160nM浓度的siRNA-liv648转染QBC939细胞后24h在mRNA和蛋白质水平均观察到Livin表达受抑，48h抑制程度最明显，而96h后Livin表达开始恢复，144h后LivinmRNA基本恢复至转染前水平。 2、转染siRNA-liv648后QBC939细胞周期发生改变，G1期细胞比例升高而S期细胞比例下降；QBC939细胞凋亡率升高(2.4±0.5％vs3.7±1.0％vs16.5±2.8％)；Livin基因抑制后细胞Caspase-3活性明显增加(0.165±0.043vs0.160±0.023vs0.347±0.058)。 3、转染siRNA-liv64848h后QBC939细胞侵袭性有所降低，穿透小室滤膜细胞数目减少(73±18.5vs96±13.5vs95±7.0个)。 结论：siRNA-liv648能有效抑制7基因的表达，在体外抑制人胆管癌细胞的生长并诱导人胆管癌细胞发生凋亡，降低其侵袭能力，为胆管癌的基因治疗提供一定的实验基础。