论文部分内容阅读
陈皮(Citri Reticulatae Pericarpium,CRP)自古就有“陈久者良”的说法,为六陈中药之一,主要用于消化和呼吸系统疾病的防治;大量研究表明,陈皮越陈越好是因其贮藏过程中活性物质的积累。本课题组前期研究表明,陈皮“陈久者良”的物质基础是多甲氧基黄酮(PMFs)的积累,但对其积累机制尚不明确;据有关报道,微生物参与了陈皮的陈化过程,且能够转化陈皮中化合物使其活性物质含量增加,基于此,本研究通过分析陈皮黄酮类物质及微生物多样性与陈皮陈化时间的关系,探究陈皮活性物质积累机制与微生物的关系。本实验以不同年份(2017、2013和2003年)的新会陈皮为原料,采用HPLC法,分析其主要黄酮类成分,利用ABTS、FRAP和DPPH法,分析陈皮总黄酮的抗氧化能力,HPLC-Q-TOF-MS分析陈皮黄酮提取物中的成分;结果表明,三个年份陈皮黄酮提取物中共检测到13种化合物,随贮藏时间的延长,黄酮提取物成分无显著差异,总黄酮含量显著增加,2003年的总黄酮含量较2017年的增长69%,其ABTS、FRAP、DPPH值均显著增高(p<0.05),说明其抗氧化能力亦增强,陈皮中的橙皮苷和川陈皮素以及桔皮素等主要黄酮类成分的含量发生显著改变,分别增加了2.61倍、1.63倍及1.56倍。采用高通量测序,对细菌16S rDNA(V3+V4)和真菌ITS:ITS1可变区进行测序分析,研究陈皮贮藏时间与其微生物多样性之间的关系;结果表明,四个不同年份(2017年、2013年、2003年和1993年)陈皮样品中共有2402个细菌OTU,2981个真菌OTU,不同年份陈皮的细菌Ace指数和Chao1指数无显著差异,而真菌Ace指数和Chao1指数均差异显著,通过样品群落相关性分析,陈皮细菌多样性与贮藏时间无相关性,而其真菌多样性与贮藏时间具有显著相关性,且随贮藏时间延长,Xeromyces耐干霉属和Xerochrysium蜡菊属的丰度增加,Symmetrospora酵母菌属的丰度降低,Mortierella被孢霉属的丰度先增加后降低。将陈皮真菌分离纯化,以18S rDNA鉴定陈皮中的真菌种类;结果从陈皮中分别分离得到18株(2017年)、13株(2013年)和8株(2003年)真菌,即不同年份分离得到的真菌数量及种类,随陈皮陈化年限的延长而减少;除去每个年份中共有的真菌,3个年份陈皮中共获得32株不同真菌。将分离得到的32株陈皮真菌以橙皮苷为唯一碳源,进行橙皮苷生物转化作用测定,采用HPLC分析菌株转化前后橙皮苷含量的变化,结合产物峰的产生情况分析陈皮真菌与橙皮苷的转化作用,筛选得到对橙皮苷具有显著转化作用的8株真菌,分别是:Aspergillus brasiliensis巴西曲霉、Aspergillus niger黑曲霉、Aspergillus tubingensis塔宾曲霉、Aspergillus aculeatus棘孢曲霉、Penicillium simplicissimum简青霉、Alternaria alternata互生交链孢霉、Aureobasidium pullulans出芽短梗霉和Clavispora lusitaniae葡萄牙棒孢酵母。每株菌对橙皮苷最大转化率时间点不同,对这8株真菌进行细胞破碎,利用磷酸缓冲液提取菌株转化酶,分析其对橙皮苷的转化作用,确定菌株中转化酶的部位在胞内、胞外或细胞碎片,结果巴西曲霉、互生交链孢霉和葡萄牙棒孢酵母的转化酶在胞内。基于HPLC和HPLC-Q-TOF-MS(LC-MS)分析8株陈皮真菌转化橙皮苷后的产物,HPLC初步分析确定目标转化产物,HPLC-Q-TOF-MS鉴定转化产物,能将橙皮苷转化为目标产物的菌株;结果巴西曲霉、黑曲霉和棘孢曲霉能转化橙皮苷,得到产物橙皮素-7-O-葡萄糖苷;巴西曲霉、塔宾曲霉、棘孢曲霉、简青霉、互生交链孢霉、出芽短梗霉和葡萄牙棒孢酵母能转化橙皮苷使其产生橙皮素;而能将橙皮苷同时转化为橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素的是巴西曲霉和棘孢曲霉。综上,不同年份陈皮中,总黄酮及主要黄酮类物质含量均存在显著差异,陈皮真菌多样性与陈皮陈化时间具有一定相关性,从陈皮中分离得到32株真菌,有8株对橙皮苷转化作用显著,具体是巴西曲霉、黑曲霉、塔宾曲霉和棘孢曲霉以及简青霉、互生交链孢霉、出芽短梗霉和葡萄牙棒孢酵母,这8株真菌的转化产物有橙皮素、没食子酸、橙皮素-7-O-葡萄糖苷和甲基橙皮苷等,其中巴西曲霉、互生交链孢霉和葡萄牙棒孢酵母的转化酶在胞内。